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上海士鋒生物科技有限公司
中級(jí)會(huì)員 | 第14年

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標(biāo)準(zhǔn)品
培養(yǎng)基
培養(yǎng)基原料 霍亂弧菌診斷血清 大腸艾希氏菌診斷血清 志賀氏菌屬診斷血清 沙門(mén)氏菌屬診斷血清 標(biāo)準(zhǔn)血清,診斷血清 抗生素藥敏紙片 微生物配套試劑 微生物生化管 管裝培養(yǎng)基 即用型液體培養(yǎng)基 一次性培養(yǎng)基平板 顯色培養(yǎng)基 臨床培養(yǎng)基 菌種保存培養(yǎng)基 四環(huán)素檢定、厭氧亞硫酸鹽還原桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 維生素檢測(cè)培養(yǎng)基 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生檢測(cè)培養(yǎng)基 罐頭食品商業(yè)無(wú)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 飲用水及水源檢測(cè)培養(yǎng)基 藥品、生物制品檢測(cè)培養(yǎng)基 化妝品檢測(cè)培養(yǎng)基 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基 啤酒檢驗(yàn)培養(yǎng)基 軍團(tuán)菌檢測(cè)培養(yǎng)基 支原體檢測(cè)培養(yǎng)基 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 彎曲桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 產(chǎn)氣莢膜梭菌、肉毒梭菌、厭氧菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 溶血性鏈球菌檢測(cè)培養(yǎng)基 李斯特氏菌檢測(cè)培養(yǎng)基 弧菌檢測(cè)培養(yǎng)基 乳酸菌、雙歧桿菌檢測(cè)培養(yǎng)基 酵母、霉菌檢測(cè)培養(yǎng)基 檢測(cè)培養(yǎng)基 沙門(mén)氏菌、志賀氏菌檢驗(yàn)培養(yǎng)基 大腸菌群、糞大腸菌群、大腸桿菌及腸桿菌科檢測(cè)培養(yǎng)基 細(xì)菌總數(shù)檢測(cè),增菌培養(yǎng)基
抗體
生物試劑
細(xì)胞
菌株
血清
細(xì)胞分離試劑
試劑盒

動(dòng)物基因組DNA/RNA提取及含量測(cè)定

時(shí)間:2015-10-26閱讀:932
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實(shí)驗(yàn)原理
核酸和蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物有機(jī)體的主要成分;核酸是生命的zui基本物質(zhì)。在生物體中它們結(jié)合成核蛋白的形式存在。核酸按其化學(xué)組成可以分成兩大類(lèi),一類(lèi)含D-2-脫氧核糖的稱(chēng)為脫氧核糖核酸(DNA),主要存在于細(xì)胞核中;另一類(lèi)含D-核糖的稱(chēng)為核糖核酸(RNA),主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi);由于核酸極不穩(wěn)定,在較劇烈的化學(xué)。物理因素和酶的作用下很易降解,因此在制備時(shí)應(yīng)防止過(guò)酸、過(guò)堿及其它引起核酸降解的因素作用。在提取中為防止組織中廣泛存在的核酸酶降解的作用,應(yīng)在低溫下進(jìn)行,必要時(shí)加入抑制劑,如檸檬酸鹽、氟化鈉、砷酸鹽等,皂土也可抑制DNA酶的活性,如果采用(SDS)或作蛋白質(zhì)變性劑來(lái)分離核酸,它們同時(shí)也可以使核酸降解酶破壞,因此常獲得較好的效果

一、RNA的提取與測(cè)定
由于RNA的種類(lèi)來(lái)源很多,因而提取制備方法各異,一般有法,去污劑法和鹽酸胍法,其中法實(shí)驗(yàn)室zui常用。組織勻漿后用處理離心,RNA即溶于上層被酚飽和的水相中,向水相加冷乙醇后, RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法較好除去DNA和蛋白質(zhì),且獲得生物活性的RNA。
工業(yè)上常用稀堿和濃鹽酸法提RNA,用這兩種方法提取的核酸均為變性RNA。主要用于制備核苷酸的原料。其工藝較簡(jiǎn)單,濃鹽法是用10%氯化鈉的溶液,在90攝氏度提取3—4小時(shí),冷卻,離心,上清液乙醇沉淀RNA。稀堿法用0.2%氫氧化鈉是酵母裂解,然后酸中和,除蛋白和菌體,上清液乙醇沉淀的RNA ,或調(diào)核酸等電點(diǎn)PI2.5沉淀。 
RNA廣泛存在啤酒酵母,面包酵母,酒精酵母和各種動(dòng)物組織中。 
本實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物肝臟經(jīng)組織搗碎,制成組織勻漿,用0.14mol/L氯化鈉溶液提取。把細(xì)胞之中的核糖核蛋白提取出來(lái),留下含有DNA的細(xì)胞核物質(zhì),調(diào)節(jié)PH4.5再將RNA和蛋白質(zhì)分開(kāi),因?yàn)樵?.14mol/L氯化鈉溶液中,RNA-蛋白溶解度大。DNA-蛋白溶解度低,而在1mol/L氯化鈉溶液中溶解度zui大。

RNA含量測(cè)定
RNA含量的測(cè)定方法很多:紫外吸收法、定磷法、常用地衣酚測(cè)定其原理是:當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時(shí),即可發(fā)生降解,形成核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛,后者與3.5-二羥基甲苯(地衣酚)反應(yīng),在鐵或銅離子催化下,生成鮮綠色復(fù)合物,反應(yīng)在670nm處有zui大吸收峰,RNA濃度在10-100μg/ml范圍內(nèi),光吸收與RNA濃度成正比,地衣酚特異性差,凡戊糖均有些反應(yīng)。

試劑和器材
材料:動(dòng)物肝臟
試劑:
0.14mol/L氯化鈉
標(biāo)準(zhǔn)RNA溶液: 100μg/ml
地衣酚試劑(現(xiàn)用現(xiàn)配)
80%溶液
95%乙醇
器材:勻漿器、離心機(jī)、分光光度計(jì)、燒杯、量筒等

操作方法
RNA提取:
勻漿:稱(chēng)取3克牛肝剪碎,加20ml 0.14mol/L氯化鈉溶液10000rn/min左右勻漿1分鐘左右
離心:勻漿后溶液離心8000 rn/min離心7分鐘,量取上清液毫升數(shù),沉淀物留做提取DNA用
除雜質(zhì):加等體積80%酚溶液于上清液中,攪拌充分混合10-20分鐘,置冰箱冷卻靜止30-40分鐘,離心取上層水相含有RNA,棄下層酚相含蛋白質(zhì)和DNA等雜質(zhì)
沉淀RNA:取上層水相含RNA溶液,加入2倍體積95%冷乙醇,攪拌,充分混合,置冰箱中冷卻,至出現(xiàn)白色絮狀物-RNA,離心8000 rn/min離心7分鐘,取沉淀物
溶解:用少量去離子水(約4毫升)溶解沉淀物,用以測(cè)定其含量

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