黃化小麥苗中提取總RNA，可以為cdna文庫(kù)的構(gòu)建做好準(zhǔn)備。我們重點(diǎn)是要保證RNA的完整性、產(chǎn)率、防止修飾和純度，尤其是完整性、防止修飾和純度。RNA是單鏈，2’OH是它的化學(xué)性質(zhì)遠(yuǎn)比DNA活潑。所以，提取RNA頗為不易。加之RNA得不均一性，要將所有的RNA（rRNA、tRNA、mRNA）*提出，更加有挑戰(zhàn)性。而Rnase是無(wú)處不在的（這種酶遇高溫后也不會(huì)喪失活性，復(fù)性容易，在胞內(nèi)外都有分布，不需激活，不需要二價(jià)金屬離子的配合）； RNA還zui怕DNA污染，因?yàn)槿糇鯮T-PCR，DNA的存在會(huì)降低產(chǎn)物的純度和效率所有以上的因素都構(gòu)成了我們成功提取RNA的障礙。但是我們可以不用考慮RNA的機(jī)械剪切，因?yàn)镽NA通常較小，一般不會(huì)受到機(jī)械剪切的影響。

實(shí)驗(yàn)原理及過(guò)程
實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)原理

1所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌，所有的試劑用DEPC配制，高溫滅菌。 去除RNA酶（外源）的影響。 高溫滅菌兩次可以破壞RNA酶的復(fù)性過(guò)程.雖然RNA酶極易復(fù)性，但兩次連續(xù)的高溫會(huì)打亂它的復(fù)性歷程，從而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。DEPC可以與RNA酶的活性中心的咪脞環(huán)上的N結(jié)合，從而使RNA酶失活。 因?yàn)镈EPC能與RNA的N結(jié)合，從而修飾RNA，所以，必須將DEPCzui終除去。在高溫滅菌時(shí)，DEPC因高溫分解而揮發(fā)。（UV也能修飾RNA，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)避免。） DEPC滅菌后稱為DEPC水，它是不含DEPC的。 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要勤換手套，必要時(shí)要在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。 2在一滅菌2mL管中加入: 5mol/L異硫氰酸胍 0.7mL 0.4mL 2mol/L NaAc(pH4.0) 0.1mL 必須提前準(zhǔn)備好變性劑。 異硫氰酸胍可以變性RNA酶，也可以破細(xì)胞。本試驗(yàn)不可以用酶法破細(xì)胞。因?yàn)榈鞍酌竗的適合的條件也可以是RNA酶有活性。 NaAc酸性可以使DNA在有機(jī)相（酚相）中，而在堿性條件下，DNA和RNA都在水相中，無(wú)法分離，所以，Ph在本是嚴(yán)重很關(guān)鍵。 用于抽提DNA和蛋白質(zhì)。 3稱取0.2g小麥黃化苗的葉片，迅速在液氮中研磨成粉末,轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的離心管中。 劇烈震蕩。 低溫防止內(nèi)源性RNA酶降解RNA。 劇烈震蕩是使所有的細(xì)胞散開，浸在變性劑中。低溫的細(xì)胞在相對(duì)來(lái)說(shuō)高溫的液體中是會(huì)形成一團(tuán)，這樣就會(huì)使內(nèi)部的RNA沒(méi)有水解RNA的機(jī)會(huì)。 小麥的黃化苗因?yàn)闆](méi)有光合作用，所以含糖少，易于抽提。 4混勻,冰浴30min。
54℃,12000rpm,10min。 6上清至另一離心管中 加0.4Ml氯仿，劇烈震蕩。冰浴放置5min。 去脂類。 740C,12000rpm,10min。 8棄有機(jī)相（下層） 加入0.4Ml氯仿和0.4Ml酚。室溫放置5min。 去脂類和蛋白質(zhì)。 940C,12000rpm,10min 棄有機(jī)相，加入等體積異丙醇。-200C放置1h。 去糖，脫水。因?yàn)轶w系高鹽（2mol/L NaAc），所以可以使RNA沉淀。 1040C,12000rpm,10min 沉淀用70%乙醇洗兩次。 因?yàn)樘岢龅牧亢苌?，可能不可見，所以離心是要有方向標(biāo)記。 11室溫稍干燥。 RNA是非常不好溶解的，所以只能稍干燥。若不溶解是因?yàn)橛刑嗟奶堑臍堄唷?12沉淀加20uLDEPC水溶解(-200C保存) DEPC水中不含RNA酶。 13RNA電泳： 1％瓊脂糖膠20 mL 8μL樣品 +1μL樣品緩沖液+1μLSYBR 100V恒壓電泳 測(cè)OD260和OD260／OD280