primer的一個(gè)重要參數(shù)是熔解溫度(Tm)。這是當(dāng)50%的primer和互補(bǔ)序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時(shí)的溫度.Tm對(duì)于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下,退火溫度足夠低,以保證primer同目的序列有效退火, 同時(shí)還要足夠高,以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設(shè)定比primer的 Tm低5℃。
設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來(lái)源于高鹽溶液中的雜交,適用于小于18堿基的primer。
有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定primerTmzui可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級(jí)結(jié)構(gòu)和 相鄰堿基的特性預(yù)測(cè)primer的雜交穩(wěn)定性。大部分計(jì)算器程序使用近鄰分析法。
根據(jù)所使用的公式及primer序列的不同,Tm會(huì)差異很大。因?yàn)榇蟛糠止教峁┮粋€(gè)估算的Tm值,所有退火溫度只是一個(gè)起始點(diǎn)??梢酝ㄟ^(guò)分析幾個(gè)逐步提高退火溫度的反應(yīng)以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會(huì)減少primer二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。
為獲得*結(jié)果,兩個(gè)primer應(yīng)具有近似的Tm值。primer對(duì)的Tm差異如果超過(guò)5℃,就會(huì)primer在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯(cuò)誤起始。如果兩個(gè)primerTm不同,將退火溫度設(shè)定為比zui低的Tm低5℃
或者為了提高特異性,可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計(jì)的退火溫度行5個(gè)循環(huán),然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計(jì)的退火溫度進(jìn)行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。