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細胞AMP含量試劑盒檢測HPLC法

2016年04月19日 14:24:40人氣:359來源:齊一生物科技(上海)有限公司

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關 鍵 詞細胞AMP含量試劑盒檢測HPLC法
【資料簡介】

細胞.植物AMP含量試劑盒檢測HPLC法測定意義: 
AMP廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中,是描述細胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù)。
測定 AMP含量并且計算能荷,能夠反映能量代謝狀態(tài)。 
測定原理: 
AMP在 254 nm下有吸收峰,可以利用液相色譜法測定其含量。 
需自備的儀器和用品: 
液相色譜儀、低速離心機、溶劑抽濾裝置、針頭式過濾器(水系,50個,0.22μm)、濾
膜(水系和有機系各1 個,0.45μm)、C18 柱(4.6 ×150 mm)、可調式移液器、樣品瓶(50
個,2mL)、甲醇(色譜級,300 mL)和蒸餾水。 
試劑的組成和配制: 
試劑一:液體60mL×1瓶,4℃保存; 
試劑二:液體60mL×1瓶,4℃保存; 
試劑三:粉劑1×1 瓶,粉劑 2×1瓶,4℃保存;臨用前用少量蒸餾水將粉劑 1 和粉劑2 溶解
后倒入 1000mL容量瓶中,用蒸餾水定容至 1000mL,形成流動相緩沖液基質(注:試劑瓶
中的粉劑要沖洗干凈), 4℃可保存 1 周; 
試劑四:AMP標準品 5mg×1 支,-20℃保存; 
實驗前的準備工作: 
1、將蒸餾水1000 mL、流動相緩沖液基質 1000 mL 和甲醇 300 mL用 0.45 μm的濾膜抽濾,
以除去溶劑中的雜質,防止堵塞色譜柱。(注:蒸餾水和緩沖液基質用水系濾膜抽濾,甲醇
用有機系濾膜抽濾)。 
2、流動相的配制:將抽濾完畢的流動相緩沖液基質 1000 mL與甲醇配比為 99.9:0.1(v/v),
即取 999mL緩沖液基質與 1mL甲醇混合。 
3、將抽濾完畢的甲醇和蒸餾水配比成 99%的甲醇,  10%的甲醇,蒸餾水各 250 mL。 
將 2 和 3 中的溶劑超聲20 分鐘,以脫去溶劑中的氣泡,防止堵塞色譜柱。 
AMP的提。 
1、組織的處理:按照組織質量(g) :試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約0.1g
組織,加入1mL試劑一),進行冰浴勻漿,4000g常溫離心 15 min,取上清液,加入等體積
的試劑二,混勻,4000 g常溫離心 15 min,取上清,針頭式過濾器過濾后待測。 
2、細胞或細菌的處理:先收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清;按照細菌或細胞數(shù)
量(104
個):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議500 萬細菌或細胞加入 1mL
試劑一) ,超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復 30
次);4000  g  常溫離心15  min,取上清液,加入等體積的試劑二,混勻,4000  g常溫離心
15 min,取上清,針頭式過濾器過濾后待測。 
標準品的配制: 
在試劑四中加入 1mL蒸餾水,配成 5mg/mL 母液,將母液用蒸餾水分別稀釋成 100 μg/mL、
80μg/mL、60μg /mL、40 μg /mL和 20 μg /mL的 AMP標準品溶液。針頭式過濾器過濾后待
測。 
AMP含量測定操作步驟: 
1.  開啟電腦、檢測器和泵,安裝上色譜柱,打開軟件,在方法組中設置進樣量 20 μL,流速
1 mL/min,保留時間 10min,檢測波長 254nm,設置完畢保存方法組。 
2.  用 99%的甲醇、10%的甲醇、蒸餾水按甲醇濃度從大到小的順序過色譜柱30min。 
3.  用流動相過柱子,待基線穩(wěn)定后開始加樣。 
4.  加入標準品 20  μL,在 10min內可分離 AMP,  AMP的保留時間在7min左右,(柱子不
同,保留時間有差異),計算不同濃度的AMP標準品的峰面積。 
5.  加入樣品20 μL,在相應保留時間處檢測 AMP的峰面積。 
AMP含量的計算: 
以標準品濃度(μg/mL)為橫坐標,峰面積為縱坐標計算 AMP 標準曲線。將樣品峰面積代
入標準曲線,計算樣品 AMP含量。 
細胞.植物AMP含量試劑盒檢測HPLC法注意事項: 
1、 為了避免使用過程中柱壓過大,流速由小到大調節(jié)。 
2、 使用完畢時,由于流動相含有緩沖鹽,用水沖洗柱子1 小時,以防止緩沖鹽結晶堵塞色
譜柱,然后用 10%的甲醇、99%的甲醇按甲醇濃度從小到大的順序洗色譜柱30min。 
3、標準品的稀釋倍數(shù)要根據(jù)樣品中 AMP濃度確定,樣品中 AMP的峰面積必須落在不同濃
度的 AMP標準品的峰面積之內,該標準品稀釋倍數(shù)只是一個參考。 
 細胞.植物AMP含量試劑盒檢測HPLC法齊一生物編以上內容詳細供參考歡迎新老客戶咨詢

齊一生物科技(上海)有限公司作者

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