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如何進(jìn)行RNA的制備

2015年12月31日 07:51:17人氣:907來(lái)源:上海士鋒生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞RNA的制備,RNA的
【資料簡(jiǎn)介】

來(lái)源于任何細(xì)胞的RNA都可以通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用拷貝成雙鏈DNA并克隆化,獲得相應(yīng)的于特定細(xì)胞來(lái)源的cdna文庫(kù)。因此,RNA制備的意義有兩個(gè)方面
* 獲得特定細(xì)胞來(lái)源的cDNA文庫(kù),克隆目的基因
* 分析基因的表達(dá),闡明基因調(diào)控的特性,了解從基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的結(jié)構(gòu),數(shù)量,水平及合成的速率
抑制rna酶活性的方法
1. 滅菌法:將RNA提取過程中的使用的器具進(jìn)行高溫滅菌處理(180 ºC,8h),溶液等在高壓下蒸汽滅菌15min(1.034 X 105 Pa)
2. 焦碳酸二乙酯(DEPC)抑制法:DEPC是RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑,塑料或玻璃器皿在含0.1%的DEPC溶液中浸泡2h,然后以滅菌水淋洗數(shù)次,在100 ºC下干烤15min。
3. RNA酶抑制劑法:利用RNA酶蛋白質(zhì)抑制劑與RNA酶緊密結(jié)合防止其發(fā)揮酶活作用;利用氧釩核糖核苷復(fù)合物與RNA酶結(jié)合;利用硅藻土吸附RNA酶。
一、細(xì)菌RNA的制備
1.菌體培養(yǎng) 同上
2. 離心收集菌體菌體
經(jīng)離心(5000g,5min)后,懸浮于終止緩沖液中(200mM Tris-HCl,pH8.0; 20 mM EDTA; 20 mM Na2N3; 20 mM 金精三羧酸(ATA))
3. 菌體裂解 
加入STET緩沖液(8% 蔗糖; 5% Triton X-100; 50mM EDTA; 50mM Tris-HCl pH 7.0)懸浮加入0.2 M 的VRC (0.2M和10 mM的氧釩核苷復(fù)合物)
4. RNA提取
加入0.5 V的振蕩1 min,0.5 V氯仿振蕩1 min,10 000 g, 10 min,水相加入1/10 V的NaAc, 2 V的無(wú)水乙醇10000 g, 10 min沉淀溶于0,2 M 的VRC,以酚-氯仿抽提兩次
5. RNA純化
重溶沉淀于DEPC(焦碳酸二乙酯)處理的水中,加入CsCl溶液,于室溫離心(200000 g,1 h)回收RNA沉淀,溶于DEPC處理的水中,加入1/10 V的3 M的NaAc, 2 V的乙醇,離心后
6.RNA的溶解
將RNA沉淀溶于水中
二、植物組織細(xì)胞RNA的制備
1.細(xì)胞處理: 將植物組織置于液氮中凍結(jié),研成粉末,加入勻漿緩沖液,高速勻漿,后高速離心(20000g,10 min) 
2.RNA提取:上清液中加入皂土(4%),等體積的酚,低溫振蕩5min,200000 g, 10 min
3.重復(fù)該步驟一次
4.RNA沉淀: 于上清液中加入KAc至終濃度為0.2 M,加兩倍體積 的無(wú)水乙醇,于0oC 30 min,30000g,20 min
5.RNA的溶解:沉淀溶于水中或TE緩沖液
三、哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)RNA的制備
1.細(xì)胞培養(yǎng): 人工組織培養(yǎng)
2.細(xì)胞裂解:以含磷酸緩沖液(PBS)的生理鹽水洗細(xì)胞懸浮于預(yù)冷的溶胞緩沖液中,加入24%的蔗糖,1%的NP-40溶胞緩沖液
3.去蛋白: 加入Protease K,于37 ºC溫育30 min,酚抽提
4.去DNA:乙醇沉淀,懸浮于DNA消化液(DNase I, 0.2% SDS)
5. 沉淀RNA: 加入終濃度為0.3 M的NaAc, 2V 無(wú)水乙醇于-20 ºC 2 h, 離心收集RNA.
四、mRNA的分離提純—寡聚(dT)-纖維素柱法
上柱緩沖液:
20 mmol/L Tris-HCl (pH7.6)
0.5 mol/L NaCl
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.1% 十二烷基肌氨酸鈉
洗脫緩沖液:
10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6)
1 mmol/L EDTA (pH8.0)
0.05% SDS
寡聚(dT)-纖維素柱法提純mRNA的過程

上海士鋒生物科技有限公司作者

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