原位微量BCA蛋白定量法

【資料簡(jiǎn)介】

簡(jiǎn)述：

傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)的BCA蛋白定量分析方法常規(guī)均使用試管或者微孔板進(jìn)行檢測(cè)，通過對(duì)傳統(tǒng)方法進(jìn)行改進(jìn)，可使用BioTek公司的Take3^TM 超微量多體積檢測(cè)板進(jìn)行原位微量BCA法蛋白定量分析。待測(cè)蛋白樣品和BCA工作緩沖液按照順序直接加在Take3TM板的微量定量孔處、溫浴，使用EpochTM 微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。和傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)BCA方法（BCA工作緩沖液和蛋白質(zhì)樣品體積比為20:1）相比，該方法的蛋白檢測(cè)靈敏度有明顯的提高。相比與Mini-BCA分析方法，原位分析方法更加。

介紹

BCA法是十分常用的蛋白質(zhì)比色定量方法，很多試劑供應(yīng)商都提供基于比色皿和微孔板的BCA蛋白定量試劑盒。BCA蛋白定量法相對(duì)于其它比色定量法具有操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。相對(duì)于蛋白質(zhì)的固有的280nm吸收峰檢測(cè)，BCA檢測(cè)法提高了蛋白檢測(cè)靈敏度和特異性，消除了核酸的干擾，核酸干擾在對(duì)細(xì)胞裂解物或其他生物樣品進(jìn)行蛋白定量時(shí)總是一個(gè)難以避免的干擾。在堿性條件下，蛋白將Cu²⁺ 還原為Cu⁺ ，Cu⁺ 與BCA 試劑形成紫色絡(luò)合物，如圖1，其吸光值與蛋白濃度成正比。測(cè)定在562nm 處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

  
圖1. BCA法蛋白質(zhì)定量。Cu（BCA）₂耦合物在592nm有一很強(qiáng)的吸收值，7700L/mol/cm。

近幾年開發(fā)的一些精密的檢測(cè)儀器，都可以使用短光程、微量體積的樣品進(jìn)行比色定量，例如NanoDrop（ThermoFisher Scientific）。這個(gè)儀器內(nèi)置了蛋白質(zhì)280nm直接定量法，這種方法可以有效的避免浪費(fèi)樣品且操作簡(jiǎn)單。在直接蛋白定量的基礎(chǔ)上，這些儀器還發(fā)展了蛋白質(zhì)比色定量法，例如BCA法。通過調(diào)整蛋白質(zhì)和BCA工作緩沖液的相對(duì)體積比，由原來的20:1調(diào)整為1:1,這種微量定量方法轉(zhuǎn)換校準(zhǔn)曲線的工作范圍，使之更適合于微孔板或短光程檢測(cè)，這種方法叫Mini-BCA法。然而對(duì)于這些通過把樣品加在檢測(cè)基座上的儀器來講，蛋白質(zhì)和BCA工作緩沖液必須先在一個(gè)額外的試劑槽里進(jìn)行混勻和溫浴，然后才能滴加到檢測(cè)基座上進(jìn)行檢測(cè)。這樣會(huì)增加操作的復(fù)雜性，增加了樣品的浪費(fèi)。

這里我們介紹一下如何使用Take3 超微量多體積檢測(cè)板進(jìn)行原位微量BCA蛋白定量法。使用Take3 超微量多體積檢測(cè)板進(jìn)行Mini-BCA法檢測(cè)操作步驟簡(jiǎn)單，整個(gè)流程和使用典型的96孔微孔板檢測(cè)相似，直接把BCA工作緩沖液和樣品滴加在Take3板的微孔處，不需要先在其它容器混勻進(jìn)行顏色反應(yīng)。這樣做的好處是可以提高操作的便捷性，每次檢測(cè)只需要2ul樣品，非常節(jié)約樣品。

實(shí)驗(yàn)材料和方法檢測(cè)試劑盒（Sigma-Aldrich公司）、小牛血清（BSA）（Sigma-Aldrich公司）。我們使用兩種實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行BCA檢測(cè)。

*種方法

按照NanoDrop技術(shù)手冊(cè)的“Mini-BCA”法。其簡(jiǎn)要流程是：BCA檢測(cè)系統(tǒng)混合好的10ulBCA工作緩沖液和10ul的標(biāo)準(zhǔn)蛋白或待測(cè)的10μl樣品（1:1）在試管中混勻，37℃溫浴30分鐘后進(jìn)行檢測(cè)。