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堿性磷酸酶鈣―鈷法
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關(guān) 鍵 詞 | 堿性磷酸酶鈣―鈷法,堿性磷酸酶 |
- 【資料簡(jiǎn)介】
磷酸 酶(phosphatase)是水解磷酸酯酶的總稱(chēng)。磷酸酶不僅參與磷酸酯化合物的水解反應(yīng)。而且也參與其逆反應(yīng)及磷酸轉(zhuǎn)移反應(yīng)。
1.堿性磷酸酶 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)在堿性環(huán)境下可催化各種酚和醇的磷酸酯水解,還具有磷酸轉(zhuǎn)移作用,在細(xì)胞膜上運(yùn)輸作用較為活躍,如腎近端小管的刷狀緣、小腸上皮的微絨毛、肝臟的膽小管、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及神經(jīng)元的突觸膜均可顯示此酶活性。
在堿性環(huán)境(;pH 9.2~9.4)中,堿性磷酸酶將磷酸鹽的底物(如β-,α-萘酚磷酸鈉)分解,產(chǎn)生的磷酸離子被孵育液中的鈣離子捕獲生成磷酸鈣沉淀。因磷酸鈣不能顯色,需加入硝酸鈷,用鈷離子置換鈣離子,形成磷酸鈷沉淀后用硫化銨處理,形成棕黑色硫化鈷顆粒沉淀,從而顯示酶活性部位,硫化鉆沉淀的多少與堿性磷酸酶含量成正比,其反應(yīng)通式
堿性磷酸酶鈣-鈷法反應(yīng)原理
1)孵育液配制
2%氯化鈣 20ml
2%鈉 10ml
3%β 10ml
5% 5ml
蒸餾水 5ml
孵育液zui終pH 9.4,置于冰箱內(nèi)保存。
2)染色程序:①新鮮組織恒冷箱切片(可用10%福爾馬林固定10分鐘,或不固定);②人孵育液,37C~孵育10分鐘(腎)至 60分鐘(肝);③流水沖洗;分鐘;④人2%硝酸鈷溶液2分鐘;⑤蒸餾水浸洗;⑥人1%硫化銨溶液內(nèi)1分鐘;⑦蒸餾水洗;⑧甘油明膠封固。
3)結(jié)果與評(píng)價(jià):酶 活性部位顯示棕黑色為硫化鈷沉淀。該法的反應(yīng)產(chǎn)物可發(fā)生擴(kuò)散,定位欠準(zhǔn)確,應(yīng)加以注意。
4)對(duì)照實(shí)驗(yàn):加入抑制劑L四咪唑等結(jié)果為陰性;去底物(孵育液中用10ml蒸餾水代替底物)結(jié)果為陰性。
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