PCR引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)

【資料簡(jiǎn)介】

實(shí)驗(yàn)方法原理	聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱(chēng)基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多，zui廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗：表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。
實(shí)驗(yàn)步驟	一、引物搜索  1.  打開(kāi)Primer premier5.0軟件，調(diào)入人瘦素（leptin）基因序列：點(diǎn)擊“file"    “open"   “ DNA sequence"；或者直接點(diǎn)擊 “file"  “new"  “DNA sequence"，彈出一對(duì)話(huà)框如下圖，然后將序列人瘦素(leptin) 基因復(fù)制在空白框。     2.  序列文件顯示如圖，點(diǎn)擊“Primer"；   3.  進(jìn)一步點(diǎn)擊“search" 按鈕，出現(xiàn)“search criteria"窗口，有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的（Seach For）有三種選項(xiàng)，PCR引物（PCR Primers），測(cè)序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類(lèi)型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成對(duì)查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges），引物長(zhǎng)度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數(shù)選擇（Search Parameters）等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。我們將Product Size設(shè)置300－350，其他參數(shù)使用默認(rèn)值。   然后點(diǎn)擊“OK" ，隨之出現(xiàn)的Search Progress窗口中顯示Search  Completed時(shí)，再點(diǎn)擊“OK"。   4、這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn)，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿(mǎn)分為100，即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)。   5.  按照搜尋結(jié)果顯示，在主窗口中檢查該引物對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)情況，逐條分析，依次篩選。下面進(jìn)行序列篩選：點(diǎn)擊其中一對(duì)引物，如第21#引物，在“Peimer Premier"主窗口，如圖所示：該圖分三部分，zui上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì)，zui下面是四種重要指標(biāo)的分析，包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)（Hairpin），二聚體（Dimer），錯(cuò)誤引發(fā)情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí)，按鈕由“None" 變成“Found" ，點(diǎn)擊該按鈕，在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu)，因此的情況是zui下面的分析欄沒(méi)有“Found"，只有“None" 。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的*退火溫度，可參考應(yīng)用。   二、引物分析  1.  打開(kāi)oligo的頁(yè)面如下：   2.  單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開(kāi)"快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrl＋O"可彈出一對(duì)話(huà)框，然后選擇序列人瘦素(leptin) 基因。出現(xiàn)以下窗口。   3.  點(diǎn)擊“window"再點(diǎn)擊“Tile"，出現(xiàn)以下窗口，圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為T(mén)m、ΔG和Frq，因?yàn)榉治鲆婕岸鄠�(gè)指標(biāo)，起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺(jué)得太擁擠，可去掉一個(gè)指標(biāo)。 ?G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度，引物的?G值在5’端和中間值比較高，而在3’端相對(duì)低。 Tm值曲線(xiàn)以選取72℃附近為佳，5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。 Frq曲線(xiàn)為“Oligo 6"新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo)，揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí)，宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。   4.  在設(shè)計(jì)時(shí)，可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列，如果覺(jué)得合適，可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時(shí)該按鈕變成紅色，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。   5.  當(dāng)上下游引物全選好以后，需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)。可以用“Analyse"菜單分析你的引物：比如有無(wú)引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高，越不符合要求。一般的檢測(cè)（非克�。┬訮CR，對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低，因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)（hairpin）；與二聚體相同，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來(lái)說(shuō)，這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過(guò)4.5為好。當(dāng)然，在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí)，引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn)，必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu)，而且能值不會(huì)太低。這種PCR需要通過(guò)靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到效果，對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量，以45-55％為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi)，這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。 當(dāng)我們結(jié)束以上三項(xiàng)檢測(cè)，按Alt+P鍵彈出PCR窗口，其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù)，zui有用的是還給出了*的*退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。 收起
注意事項(xiàng)	1.  注意：在填antisense時(shí)要注意3’到5’翻轉(zhuǎn)成5’到3’
其他	一、引物設(shè)計(jì)原則  聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction）即PCR技術(shù)，是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法，故又稱(chēng)基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多，zui廣泛的手段之一，而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)，使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失�。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶（如形成引物二聚體帶），不出帶或出帶很弱，等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行，可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè)，得到設(shè)計(jì)好的引物，也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。 引物設(shè)計(jì)原則如下 1.  引物應(yīng)在序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并具有特異性。引物序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū)，且與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結(jié)合，提高反應(yīng)的特異性； 2.  引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)； 3.  引物不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高(超過(guò)4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行； 4.  引物序列的GC含量一般為40-60%。過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大； 5.  引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件*。Tm值的計(jì)算有多種方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)； 6.  引物5'端序列對(duì)PCR影響不太大，因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物�？筛鶕�(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。 7.  引物3’端不可修飾。引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率，末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A。 8.  引物序列自身或者引物之間不能在出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加； 9.  G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端G值較低（值不超過(guò)9），而5’端和中間G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的G值過(guò)高，容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)； 值得一提的是，各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難，例如GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定，引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低，在這種情況只能退而求其次，盡量去滿(mǎn)足條件。 二、引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0及oligo6.0  “Premier"的主要功能分四大塊，其中有三種功能比較常用，即引物設(shè)計(jì)、限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA 基元(motif)查找�！癙remier"還具有同源性分析功能，但并非其特長(zhǎng)，在此略過(guò)。此外，該軟件還有一些特殊功能，其中zui重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，另外還有序列“朗讀"、DNA 與蛋白序列的互換、語(yǔ)音提示鍵盤(pán)輸入等等。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA 來(lái)設(shè)計(jì)引物，由于大多數(shù)氨基酸（20 種常見(jiàn)結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA 序列時(shí)，會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物，它們的序列組成大部分相同，但在某些位點(diǎn)有所變化，稱(chēng)之為簡(jiǎn)并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異，比如在線(xiàn)粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的�！癙remier"可以針對(duì)模板DNA 的來(lái)源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶(hù)選擇，有纖毛蟲(chóng)大核（Ciliate Macronuclear）、無(wú)脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體（Invertebrate Mitochondrion）、支原體（Mycoplasma）、植物線(xiàn)粒體（Plant Mitochondrion）、原生動(dòng)物線(xiàn)粒體（Protozoan Mitochondrion）、一般標(biāo)準(zhǔn)（Standard）、脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體（Vertebrate Mito-chondrion）和酵母線(xiàn)粒體（Yeast Mitochondrion）。   對(duì)引物進(jìn)行分析評(píng)價(jià)的的軟件中，“oligo" 是zui的。它的使用并不十分復(fù)雜，Oligo 6.0的界面是三個(gè)圖，Tm圖、ΔG圖和Frq圖�！癘ligo"的功能比“Premier"還要單一，就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能。所以引物設(shè)計(jì)的*搭配是“Premier"進(jìn)行引物搜索“Oligo" 對(duì)引物分析評(píng)價(jià)。 二、作業(yè)  1.  提交使用Primer premier5.0及oligo6.0軟件進(jìn)行人瘦素(leptin) mRNA引物的設(shè)計(jì)結(jié)果； （1）使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0進(jìn)行人瘦素(leptin) mRNA引物搜索結(jié)果截圖。（包括S鏈和A鏈截圖） （2）oligo6.0分析此對(duì)引物的結(jié)果。（包括Duplex formation、Hairpin formation、False Priming Sites截圖） （3）綜合Primer premier5.0與oligo6的引物設(shè)計(jì)結(jié)果為