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PCR引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)
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實(shí)驗(yàn)方法原理 聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)即PCR技術(shù),是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法,故又稱(chēng)基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多,zui廣泛的手段之一,而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán),使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗:表現(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶(如形成引物二聚體帶),不出帶或出帶很弱,等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行,可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè),得到設(shè)計(jì)好的引物,也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。 實(shí)驗(yàn)步驟 一、引物搜索
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1. 打開(kāi)Primer premier5.0軟件,調(diào)入人瘦素(leptin)基因序列:點(diǎn)擊“file" “open" “ DNA sequence";或者直接點(diǎn)擊 “file" “new" “DNA sequence",彈出一對(duì)話(huà)框如下圖,然后將序列人瘦素(leptin) 基因復(fù)制在空白框。
2. 序列文件顯示如圖,點(diǎn)擊“Primer";
3. 進(jìn)一步點(diǎn)擊“search" 按鈕,出現(xiàn)“search criteria"窗口,有多種參數(shù)可以調(diào)整。搜索目的(Seach For)有三種選項(xiàng),PCR引物(PCR Primers),測(cè)序引物(Sequencing Primers),雜交探針(Hybridization Probes)。搜索類(lèi)型(Search Type)可選擇分別或同時(shí)查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer,或Both),或者成對(duì)查找(Pairs),或者分別以適合上、下游引物為主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer)。另外還可改變選擇區(qū)域(Search Ranges),引物長(zhǎng)度(Primer Length),選擇方式(Search Mode),參數(shù)選擇(Search Parameters)等等。使用者可根據(jù)自己的需要設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)。我們將Product Size設(shè)置300-350,其他參數(shù)使用默認(rèn)值。
然后點(diǎn)擊“OK" ,隨之出現(xiàn)的Search Progress窗口中顯示Search Completed時(shí),再點(diǎn)擊“OK"。
4、這時(shí)搜索結(jié)果以表格的形式出現(xiàn),有三種顯示方式,上游引物(Sense),下游引物(Anti-sense),成對(duì)顯示(Pairs)。默認(rèn)顯示為成對(duì)方式,并按優(yōu)劣次序(Rating)排列,滿(mǎn)分為100,即各指標(biāo)基本都能達(dá)標(biāo)。
5. 按照搜尋結(jié)果顯示,在主窗口中檢查該引物對(duì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)情況,逐條分析,依次篩選。下面進(jìn)行序列篩選:點(diǎn)擊其中一對(duì)引物,如第21#引物,在“Peimer Premier"主窗口,如圖所示:該圖分三部分,zui上面是圖示PCR模板及產(chǎn)物位置,中間是所選的上下游引物的一些性質(zhì),zui下面是四種重要指標(biāo)的分析,包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin),二聚體(Dimer),錯(cuò)誤引發(fā)情況(False Priming),及上下游引物之間二聚體形成情況(Cross Dimer)。當(dāng)所分析的引物有這四種結(jié)構(gòu)的形成可能時(shí),按鈕由“None" 變成“Found" ,點(diǎn)擊該按鈕,在左下角的窗口中就會(huì)出現(xiàn)該結(jié)構(gòu)的形成情況。一對(duì)理想的引物應(yīng)當(dāng)不存在任何一種上述結(jié)構(gòu),因此的情況是zui下面的分析欄沒(méi)有“Found",只有“None" 。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的*退火溫度,可參考應(yīng)用。
二、引物分析
1. 打開(kāi)oligo的頁(yè)面如下:
2. 單擊file菜單再點(diǎn)open或點(diǎn)擊“打開(kāi)"快捷圖標(biāo)或者用快捷鍵“CTrl+O"可彈出一對(duì)話(huà)框,然后選擇序列人瘦素(leptin) 基因。出現(xiàn)以下窗口。
3. 點(diǎn)擊“window"再點(diǎn)擊“Tile",出現(xiàn)以下窗口,圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)分別為T(mén)m、ΔG和Frq,因?yàn)榉治鲆婕岸鄠(gè)指標(biāo),起動(dòng)窗口的cascade排列方式不太方便,可從windows菜單改為tile方式。如果覺(jué)得太擁擠,可去掉一個(gè)指標(biāo)。
?G值反映了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度,引物的?G值在5’端和中間值比較高,而在3’端相對(duì)低。
Tm值曲線(xiàn)以選取72℃附近為佳,5’到3’的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。
Frq曲線(xiàn)為“Oligo 6"新引進(jìn)的一個(gè)指標(biāo),揭示了序列片段存在的重復(fù)機(jī)率大小。選取引物時(shí),宜選用3’端Frq值相對(duì)較低的片段。
4. 在設(shè)計(jì)時(shí),可依據(jù)圖上三種指標(biāo)的信息選取序列,如果覺(jué)得合適,可點(diǎn)擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕,選好上游引物,此時(shí)該按鈕變成紅色,表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上,只是按鈕變成Lower。
5. 當(dāng)上下游引物全選好以后,需要對(duì)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)。可以用“Analyse"菜單分析你的引物:比如有無(wú)引物二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)等等。首先檢查引物二聚體尤其是3’端二聚體形成的可能性。需要注意的是,引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成,也有可能是在上下游引物之間形成(cross dimer)。二聚體形成的能值越高,越不符合要求。一般的檢測(cè)(非克。┬訮CR,對(duì)引物位置、產(chǎn)物大小要求較低,因而應(yīng)盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。第二項(xiàng)檢查是發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin);與二聚體相同,發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值越低越好。一般來(lái)說(shuō),這兩項(xiàng)結(jié)構(gòu)的能值以不超過(guò)4.5為好。當(dāng)然,在設(shè)計(jì)克隆目的的PCR引物時(shí),引物兩端一般都添加酶切位點(diǎn),必然存在發(fā)夾結(jié)構(gòu),而且能值不會(huì)太低。這種PCR需要通過(guò)靈活調(diào)控退火溫度以達(dá)到效果,對(duì)引物的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的檢測(cè)就不應(yīng)要求太高。第三項(xiàng)檢查為GC含量,以45-55%為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高,導(dǎo)致引物的GC含量不能被控制在上述范圍內(nèi),這時(shí)應(yīng)盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近,以有利于退火溫度的選擇。
當(dāng)我們結(jié)束以上三項(xiàng)檢測(cè),按Alt+P鍵彈出PCR窗口,其中總結(jié)性地顯示該引物的位置、產(chǎn)物大小、Tm值等參數(shù),zui有用的是還給出了*的*退火溫度和簡(jiǎn)單的評(píng)價(jià)。注意事項(xiàng) 1. 注意:在填antisense時(shí)要注意3’到5’翻轉(zhuǎn)成5’到3’
其他 一、引物設(shè)計(jì)原則
聚合梅鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction)即PCR技術(shù),是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA 序列的方法,故又稱(chēng)基因的體外擴(kuò)增法。PCR技術(shù)已成為分子生物學(xué)研究中使用zui多,zui廣泛的手段之一,而引物設(shè)計(jì)是PCR技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán),使用不合適的PCR引物容易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失。罕憩F(xiàn)為擴(kuò)增出目的帶之外的多條帶(如形成引物二聚體帶),不出帶或出帶很弱,等等。現(xiàn)在PCR引物設(shè)計(jì)大都通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行,可以直接提交模板序列到特定網(wǎng)頁(yè),得到設(shè)計(jì)好的引物,也可以在本地計(jì)算機(jī)上運(yùn)行引物設(shè)計(jì)專(zhuān)業(yè)軟件。
引物設(shè)計(jì)原則如下
1. 引物應(yīng)在序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并具有特異性。引物序列應(yīng)位于基因組DNA的高度保守區(qū),且與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列。這樣可以減少引物與基因組的非特異結(jié)合,提高反應(yīng)的特異性;
2. 引物的長(zhǎng)度一般為15-30 bp。常用的是18-27 bp,但不應(yīng)大于38,因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng);
3. 引物不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過(guò)高(超過(guò)4.5kcal/mol)易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶,并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行;
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%。過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大;
5. 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件*。Tm值的計(jì)算有多種方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T);
6. 引物5'端序列對(duì)PCR影響不太大,因此常用來(lái)引進(jìn)修飾位點(diǎn)或標(biāo)記物?筛鶕(jù)下一步實(shí)驗(yàn)中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
7. 引物3’端不可修飾。引物3'端的末位堿基對(duì)Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯(cuò)配位置導(dǎo)致不同的擴(kuò)增效率,末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基,因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3'端使用堿基A。
8. 引物序列自身或者引物之間不能在出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基,如GGG或CCC,也會(huì)使錯(cuò)誤引發(fā)機(jī)率增加;
9. G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能,該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對(duì)的相對(duì)穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3'端G值較低(值不超過(guò)9),而5’端和中間G值相對(duì)較高的引物。引物的3’端的G值過(guò)高,容易在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng);
值得一提的是,各種模板的引物設(shè)計(jì)難度不一。有的模板本身?xiàng)l件比較困難,例如GC含量偏高或偏低,導(dǎo)致找不到各種指標(biāo)都十分合適的引物;在用作克隆目的的PCR因?yàn)楫a(chǎn)物序列相對(duì)固定,引物設(shè)計(jì)的選擇自由度較低,在這種情況只能退而求其次,盡量去滿(mǎn)足條件。
二、引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0及oligo6.0
“Premier"的主要功能分四大塊,其中有三種功能比較常用,即引物設(shè)計(jì)、限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)分析和DNA 基元(motif)查找!癙remier"還具有同源性分析功能,但并非其特長(zhǎng),在此略過(guò)。此外,該軟件還有一些特殊功能,其中zui重要的是設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,另外還有序列“朗讀"、DNA 與蛋白序列的互換、語(yǔ)音提示鍵盤(pán)輸入等等。有時(shí)需要根據(jù)一段氨基酸序列反推到DNA 來(lái)設(shè)計(jì)引物,由于大多數(shù)氨基酸(20 種常見(jiàn)結(jié)構(gòu)氨基酸中的18 種)的遺傳密碼不只一種,因此,由氨基酸序列反推DNA 序列時(shí),會(huì)遇到部分堿基的不確定性。這樣設(shè)計(jì)并合成的引物實(shí)際上是多個(gè)序列的混和物,它們的序列組成大部分相同,但在某些位點(diǎn)有所變化,稱(chēng)之為簡(jiǎn)并引物。遺傳密碼規(guī)則因物種或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的不同而異,比如在線(xiàn)粒體內(nèi)的遺傳密碼與細(xì)胞核是不一樣的!癙remier"可以針對(duì)模板DNA 的來(lái)源以相應(yīng)的遺傳密碼規(guī)則轉(zhuǎn)換DNA 和氨基酸序列。軟件共給出八種生物亞結(jié)構(gòu)的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶(hù)選擇,有纖毛蟲(chóng)大核(Ciliate Macronuclear)、無(wú)脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體(Invertebrate Mitochondrion)、支原體(Mycoplasma)、植物線(xiàn)粒體(Plant Mitochondrion)、原生動(dòng)物線(xiàn)粒體(Protozoan Mitochondrion)、一般標(biāo)準(zhǔn)(Standard)、脊椎動(dòng)物線(xiàn)粒體(Vertebrate Mito-chondrion)和酵母線(xiàn)粒體(Yeast Mitochondrion)。
對(duì)引物進(jìn)行分析評(píng)價(jià)的的軟件中,“oligo" 是zui的。它的使用并不十分復(fù)雜,Oligo 6.0的界面是三個(gè)圖,Tm圖、ΔG圖和Frq圖!癘ligo"的功能比“Premier"還要單一,就是引物設(shè)計(jì)。但它的引物分析功能如此強(qiáng)大以至于能。所以引物設(shè)計(jì)的*搭配是“Premier"進(jìn)行引物搜索“Oligo" 對(duì)引物分析評(píng)價(jià)。
二、作業(yè)
1. 提交使用Primer premier5.0及oligo6.0軟件進(jìn)行人瘦素(leptin) mRNA引物的設(shè)計(jì)結(jié)果;
(1)使用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0進(jìn)行人瘦素(leptin) mRNA引物搜索結(jié)果截圖。(包括S鏈和A鏈截圖)
(2)oligo6.0分析此對(duì)引物的結(jié)果。(包括Duplex formation、Hairpin formation、False Priming Sites截圖)
(3)綜合Primer premier5.0與oligo6的引物設(shè)計(jì)結(jié)果為
2025世環(huán)會(huì)【工業(yè)節(jié)能與環(huán)保展】

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