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直接免疫熒光法測抗原

2015年01月08日 07:25:37人氣:664來源:上海士鋒生物科技有限公司

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關(guān) 鍵 詞直接免疫熒光法測抗原,直接免疫熒
【資料簡介】

一、基本原理:

將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,直接與相應(yīng)抗原反應(yīng).其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便.  特異性高,非特異性熒光染色少.缺點(diǎn)是敏感性偏低;而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體.此法常用于細(xì)菌.  病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢.  皮膚活檢的免疫病理檢查。


二、試劑與儀器:

1.  磷酸鹽緩沖鹽水(PBS):0.01 mol/L,pH7.4

2.  熒光標(biāo)記的抗體溶液:以0.01 mol/L,pH7.4的PBS進(jìn)行稀釋

3.  緩沖甘油:分析純無熒光的甘油9份+ pH9.2,0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制

4.  搪瓷桶三只(內(nèi)有0.01 mol/L,pH7.4的PBS 1500 ml)

5.  有蓋搪瓷盒一只(內(nèi)鋪一層浸濕的紗布?jí)|)

6.  熒光顯微鏡

7.  玻片架

8.  濾紙

9.  37℃溫箱等


三、實(shí)驗(yàn)步驟:

1.  滴加0.01 mol/L,pH7.4的PBS于待檢標(biāo)本片上,10 min后棄去,使標(biāo)本保持一定濕度;

2.  滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記的抗體溶液,使其*覆蓋標(biāo)本,置于有蓋搪瓷盒內(nèi),保溫一定時(shí)間(參考:30 min);

3.  取出玻片,置玻片架上,先用0.01 mol/L,pH7.4的PBS沖洗后,再按順序過0.01 mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不時(shí)振蕩;

4.  取出玻片,用濾紙吸去多余水分,但不使標(biāo)本干燥,加一滴緩沖甘油,以蓋玻片覆蓋;

5.  立即用熒光顯微鏡觀察.觀察標(biāo)本的特異性熒光強(qiáng)度,一般可用"+"表示:(-)無熒光;(±)極弱的可疑熒光;(+)熒光較弱,但清楚可見;(++)熒光明亮;(+++ --++++)熒光閃亮.待檢標(biāo)本特異性熒光染色強(qiáng)度達(dá)"++"以上,而各種對(duì)照顯示為(±)或(-),即可判定為陽性。


四、注意事項(xiàng):

1.  對(duì)熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,要保證抗體的蛋白有一定的濃度,一般稀釋度不應(yīng)超過1:20,抗體濃度過低,會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,影響結(jié)果的觀察。

2.  染色的溫度和時(shí)間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,染色時(shí)間可以從10 min到數(shù)小時(shí),一般30 min已足夠.染色溫度多采用室溫(25℃左右),高于37℃可加強(qiáng)染色效果,但對(duì)不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0~2℃的低溫,延長染色時(shí)間.低溫染色過夜較37℃30 min效果好的多。

3.  為了保證熒光染色的正確性,試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,以排除某些非特異性熒光染色的干擾.

(1)標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照:標(biāo)本加1~2滴0.01 mol/L,pH7.4的PBS。

(2)特異性對(duì)照(抑制試驗(yàn)):標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

(3)陽性對(duì)照:已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。

    如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,則為特異性陽性染色。

4.  一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3 min,就有熒光減弱現(xiàn)象,經(jīng)熒光染色的標(biāo)本在當(dāng)天觀察,隨著時(shí)間的延長,熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降。

上海士鋒生物科技有限公司作者

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