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檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒抗體
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關(guān) 鍵 詞 | 豬,腹瀉病毒 |
- 【資料簡(jiǎn)介】
- 實(shí)驗(yàn)試劑1. 聚苯乙烯塑料微量組織培養(yǎng)板:4×10孔。2. 包被液(pH9.6):NaHCO3 29.3g、Na2CO3 19.5g,蒸餾水加至1000ml,置4℃保存。
3. 洗滌液(0.01mol/L、pH7.4PBS):NaCl 8.0g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4•12 H2O 2.9g、KCl 0.2g、Tween20 0.5ml,加蒸餾水至1000ml。
4. 保溫液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1g、0.05% PBSTween20 100ml,4℃保存。5. 底物溶液(OPDH2O2)磷酸鹽檸檬酸緩沖液(pH5.0):0.2mol/L Na2HPO4(28.4g/L)25.7ml、0.1mol/L檸檬酸(19.2g/L)24.3ml、蒸餾水50ml。底物溶液:磷酸鹽檸檬酸緩沖液100ml、鄰苯二胺(OPD)40mg、30%H2O2 0.15ml,現(xiàn)配現(xiàn)用。6. 終止液(2mol/L H2SO4):濃硫酸22.2ml、蒸餾水177.8ml。7. 豬流行性腹瀉(PED)抗原:PEDV豬胎腸原代細(xì)胞培養(yǎng)物,反復(fù)凍融,65℃ 30min滅活。zui后以3 000 r/min離心30min,取上清分裝,-20℃保存?zhèn)溆???乖牡鞍诐舛葹?/span>300μg/ml。8. 酶標(biāo)兔抗豬抗體結(jié)合物:酶結(jié)合物效價(jià)為1∶10 000。9. 被檢豬血清:采自疫區(qū)豬和病豬。PEDV免疫豬血清及健豬血清分別用于陽(yáng)性、陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)設(shè)備酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)儀實(shí)驗(yàn)步驟1. 抗原包被:用包被液將PEDV抗原作1∶5稀釋包被反應(yīng)板,每孔100μl,同時(shí)設(shè)陰性細(xì)胞培養(yǎng)物對(duì)照孔,置4℃。2. 洗滌:用洗滌液洗滌2次,每次2min,瀝干。3. 加入被檢血清:用保溫液將被檢血清作1∶100稀釋,加入反應(yīng)板相鄰的兩個(gè)孔中,每孔100μl。同時(shí)作陰、陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)血清對(duì)照,置37℃孵育1h。4. 洗滌3次:方法同上。5. 加入酶結(jié)合物:用保溫液將酶結(jié)合物作1∶4 000稀釋,加入反應(yīng)孔中,每孔100μl,置37℃孵育1h。6. 洗滌3次:方法同上。7. 加入底物:每孔100μl,置室溫暗盒內(nèi)顯色20min。8. 加入終止液:每孔50μl,靜置5min。9. 測(cè)定OD值:用檢測(cè)儀,于492nm波長(zhǎng),按儀器使用及制定標(biāo)準(zhǔn)要求調(diào)節(jié)儀器,測(cè)定各反應(yīng)孔的OD值,記錄結(jié)果。結(jié)果判定凡檢測(cè)血清P/N值超過(guò)14的,均判為陽(yáng)性。肉眼觀察,凡反應(yīng)孔的顏色比正常細(xì)胞對(duì)照孔、正常血清對(duì)照孔顏色深者為陽(yáng)性。注意事項(xiàng)1. 在各載體中使用zui多的為聚苯乙烯塑料板。不同廠牌,甚至不同批號(hào)的反應(yīng)板吸附性能往往有很大差異,因此使用前需要加以選擇。方法為:在整塊板上測(cè)定同一標(biāo)本,求出每一對(duì)孔的平均OD值,將此值與該板的總均值相比,其差值需在±10%以內(nèi)。2. 為了增加聚苯乙烯板對(duì)某些抗原或抗體的吸附作用,可試用鞣酸處理,牛血清白蛋白處理,改變載體的表面電荷,引入化學(xué)基團(tuán)等方法處理反應(yīng)板。3. 如非特異性吸附較強(qiáng),需考慮采用封閉等方法排除。1) 封閉:可選用4%~10%牛血清白蛋白、10%小牛血清、10%馬血清、01%~25%明膠等。2) 去污劑:可阻止非特異吸附,而不影響特異性抗原抗體反應(yīng)。常用的有005%~05%吐溫20、吐溫80、01%NP40等。3) 高鹽濃度緩沖液:如含05mol/L NaCl及0.05%吐溫的磷酸鹽緩沖液(pH8)。4) 縮短孵育時(shí)間:保溫液中加入終濃度4%的聚乙二醇(PEG,MW6 000)可縮短抗原抗體反應(yīng)的孵育時(shí)間(20min以內(nèi))。4. 由于反應(yīng)板可能存在邊緣效應(yīng),因此測(cè)定標(biāo)本時(shí)至少要取兩孔的平均值。5. 各種常用的酶標(biāo)反應(yīng)比色計(jì)性能不一,測(cè)定時(shí)需根據(jù)各自的儀器確定閾值。
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