內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療腦血管痙攣的免疫組化研究

【資料簡(jiǎn)介】

【摘要】目的： 應(yīng)用免疫組化方法探討ET1在蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）引起的腦血管痙攣（CVS）中的作用，以及［DVal22］大ET1（1638）對(duì)基底動(dòng)脈壁 ET1表達(dá)的影響和不同用藥方式和時(shí)機(jī)的作用是否相同.方法： 采用枕大池雙注血法制備36只兔SAH后CVS模型，隨機(jī)分成生理鹽水對(duì)照組、SAH組、腦池給藥預(yù)防組、靜脈給藥預(yù)防組、腦池給藥治療組和靜脈給藥治療組.全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于注血后7 d進(jìn)行灌注固定，留取基底動(dòng)脈和腦組織標(biāo)本，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，觀察ET1的免疫表達(dá).結(jié)果： ET1免疫陽(yáng)性標(biāo)記顆粒在生理鹽水對(duì)照組散在不規(guī)則表達(dá)，而在SAH組血管壁各層都有重度表達(dá).用藥預(yù)防和治療組免疫染色強(qiáng)度基本一致，血管壁各層的ET1免疫反應(yīng)強(qiáng)度介入SAH和對(duì)照組之間.結(jié)論： ［DVal22］大ET1（1638）可明顯抑制基底動(dòng)脈壁ET1的免疫表達(dá)，無(wú)論腦池還是靜脈給藥均能夠達(dá)到有效地預(yù)防和治療SAH后CVS.

　　【關(guān)鍵詞】 蛛網(wǎng)膜下腔出血；血管痙攣，顱內(nèi)；內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶抑制劑；內(nèi)皮縮血管肽1；免疫組織化學(xué)

　　0引言

　　蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后腦血管痙攣（CVS）所導(dǎo)致的缺血性損害是顱內(nèi)破裂動(dòng)脈瘤死亡率和致殘率居高不下的主要原因［1］，但腦血管痙攣的確切發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚.大量的實(shí)驗(yàn)研究表明含有21個(gè)氨基酸、具有明顯劑量依賴，可持久收縮血管的多肽――內(nèi)皮素（ET1）是SAH后CVS的發(fā)生過(guò)程中的重要致病因子.SAH后血液溶解產(chǎn)物通過(guò)各種途徑促進(jìn)了ET1的釋放和生物合成，同時(shí)破壞和抑制一氧化氮（NO）的生物學(xué)作用，使維持腦血管正常舒張和收縮的平衡遭到了破壞，導(dǎo)致CVS發(fā)生.實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶ECE抑制劑［DVal22］大ET1（16~38）可有效預(yù)防SAH后CVS的發(fā)生［2］，但其是否可以治療或逆轉(zhuǎn)SAH后CVS，不同途徑給藥是否可以同樣發(fā)揮預(yù)防和治療SAH后CVS，對(duì)基底動(dòng)脈內(nèi)膜和平滑肌中ET1的免疫表達(dá)有何影響均未見報(bào)道.本研究的目的是探討［DVal22］大ET1（16~38）對(duì)基底動(dòng)脈壁 ET1的表達(dá)的影響以及不同用藥方式和時(shí)機(jī)的抑制作用是否相同.

　　1材料和方法

　　11材料

　　二級(jí)新西蘭白兔36只（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），雌雄不限，體質(zhì)量26～32 kg，平均28 kg，2×10-5mol/L內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶（ECE）抑制劑（DVal22）大ET1（1638）生理鹽水溶液（Peptides Co. 美國(guó)），1∶300兔二抗PBS溶液（博士德，武漢），1∶200抗內(nèi)皮素抗體PBS溶液（博士德，武漢），40 g/L的多聚甲醛固定液，1∶500 ABC復(fù)合物，DAB硫酸鎳胺顯色液.

　　12方法

　　121動(dòng)物模型白兔枕部剃毛，消毒后于枕部中線作一直切口，長(zhǎng)25 cm，銳性分離直達(dá)寰枕筋膜，充分顯露寰枕部，用18G*與軀體成角約30°穿刺枕大池，退出針芯，此時(shí)可見清亮CSF流出.取自體股動(dòng)脈的非抗凝血25 mL，緩慢注入枕大池內(nèi).退出*，局部壓迫后，縫合切口，取側(cè)臥頭低30°位放置30 min，使血液集積在腦基底池.注血后48 h，由兔耳*動(dòng)脈取血25 mL，按上述方法，再次注入枕大池內(nèi).

　　122分組將36只動(dòng)物模型隨機(jī)分為6組： ① 對(duì)照組，枕大池內(nèi)注射生理鹽水25 mL，48 h后再次注射25 mL生理鹽水.② SAH組，注射自體動(dòng)脈血25 mL，48 h后再次注射25 mL自體動(dòng)脈血.③ 腦池給藥預(yù)防組，枕大池內(nèi)注射自體動(dòng)脈血25 mL.隨后注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38）生理鹽水，48 h后先后注射25 mL自體動(dòng)脈血和05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.④ 靜脈給藥預(yù)防組，枕大池內(nèi)注射自體動(dòng)脈血25 mL.同時(shí)靜脈內(nèi)注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.48 h后枕大池再次注射25 mL自體動(dòng)脈血，靜脈內(nèi)注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.⑤ 腦池給藥治療組，枕大池內(nèi)注射自體動(dòng)脈血25 mL.24 h后枕大池內(nèi)注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.注血48 h后枕大池內(nèi)再次注射25 mL自體動(dòng)脈血，24 h后枕大池注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.⑥ 靜脈給藥治療組，枕大池內(nèi)注血25 mL.24 h后靜脈內(nèi)注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.注血48 h后枕大池內(nèi)再次注射25 mL自體動(dòng)脈血，24 h后靜脈內(nèi)注射05 mL［DVal22］大ET1（16~38） 生理鹽水.

123灌注固定所有白兔飼養(yǎng)7 d后，以10 g/L的戊*鈉麻醉（30 mg/kg），打開胸腔，撥開*，暴露心臟，剪開右心房放出血液，再剪開左心室將灌注頭插入主動(dòng)脈用*固定，先輸入生理鹽水將血管內(nèi)的血沖洗干凈，再注入40 g/L的多聚甲醛固定液2000 mL灌流固定.

　　124免疫組織化學(xué)標(biāo)本將基底動(dòng)脈標(biāo)本放入200 g/L蔗糖液中4℃下浸泡24 h，直至組織*沉底.將標(biāo)本在恒冷箱切片機(jī)制作成14 μm切片，應(yīng)用ABC法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，在光鏡下進(jìn)行觀察.

　　2結(jié)果

　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在攝食、飲水、睡眠及體質(zhì)量等指標(biāo)與對(duì)照組動(dòng)物未見有何差別，枕大池注血及［DVal22］大ET1（1638）治療后未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)功能障礙.灌注取標(biāo)本，肉眼下可見凝血塊主要聚積在腦基底池和基底動(dòng)脈周圍.

　　對(duì)照組標(biāo)本可見基底動(dòng)脈內(nèi)膜細(xì)胞上可見散在不規(guī)則ET1免疫陽(yáng)性標(biāo)記顆粒，平滑肌內(nèi)則未見免疫陽(yáng)性標(biāo)記顆粒（Fig 1A）.而珠網(wǎng)膜下腔出血組動(dòng)物的基底動(dòng)脈的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌和外膜上ET1重度染色，以內(nèi)皮細(xì)胞zui為突出（Fig 1B）.而其他4組，腦池給藥預(yù)防組、靜脈給藥預(yù)防組 、腦池給藥治療組和靜脈給藥治療組免疫染色強(qiáng)度基本一致，血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌和外膜ET1免疫反應(yīng)明顯變淡，仍可見免疫陽(yáng)性標(biāo)記顆粒，血管壁各層的ET1免疫反應(yīng)強(qiáng)度介入珠網(wǎng)膜下腔出血組和對(duì)照組之間（Fig 1C）.鄰近基底動(dòng)脈的腦組織（腦干）在各組中未見明顯的免疫染色.

　　3討論

　　ET1是ET家族中活性的多肽，在活體和離體實(shí)驗(yàn)中均可引起一種劑量依賴性，持久的縮血管反應(yīng)［3］.在SAH后應(yīng)激反應(yīng)可使全身血管內(nèi)皮合成和分泌增加，引起血漿中ET含量升高，此情形下腦血管內(nèi)皮合成和分泌的ET有可能穿過(guò)基底膜作用于平滑肌， 引起腦血管痙攣［4］. Ohkuma等［5］應(yīng)用免疫組化分析前ET原反義寡DNA治療犬SAH后CVS時(shí)發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組血管EC，中層SMC和外膜ET1產(chǎn)物的表達(dá)弱而不規(guī)則，而SAH后 2、4和7 d腦血管EC，SM和外膜均可見到不同程度的免疫反應(yīng)性ET1產(chǎn)物.Shigeno等［6］采用免疫組化染色發(fā)現(xiàn)正?；讋?dòng)脈僅在內(nèi)皮上可見散在的ET染色，而SAH后3 d內(nèi)層全層可見過(guò)度的免疫表達(dá).放射菌素D（非特異性ECE抑制劑）治療組，ET的免疫反應(yīng)被抑制，SAH組表達(dá)明顯.以上研究說(shuō)明ET1與腦血管痙攣有明確的關(guān)系.

　　本研究通過(guò)免疫組化法證實(shí)對(duì)照組內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)可見散在的，不規(guī)則的ET免疫染色，SAH后7 d EC 、SM和外膜重度染色，以ECzui為突出.［DVal22］大ET1（16~38）預(yù)防組，治療組及不同用藥方法組，ET染色淡，介于對(duì)照組和SAH組之間，而且不同途徑給予的治療組和預(yù)防組之間沒(méi)有明顯的差別.此結(jié)果表明： SAH后血液溶解產(chǎn)物可能刺激了EC、SM和外膜內(nèi)源性ET的表達(dá),破壞了ET1和NO之間的平衡，導(dǎo)致CVS發(fā)生；證實(shí)內(nèi)源性ET1在CVS發(fā)展過(guò)程發(fā)揮了重要作用；［DVal22］大ET1（16~38）有效地阻斷了無(wú)活性大ET1轉(zhuǎn)化成具有活性的ET1，使ET1表達(dá)下降，不僅能夠預(yù)防腦血管痙攣的發(fā)生，同時(shí)能夠治療珠網(wǎng)膜下腔出血引起的腦血管痙攣.但是本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)SAH后7 d ET的免疫反應(yīng)進(jìn)行了觀察，而SAH后不同時(shí)間內(nèi)的表達(dá)規(guī)律如何？［DVal22］大ET1（16~38對(duì)ET1的免疫反應(yīng)有何影響？需進(jìn)一步研究.

　　那么SAH后引起收縮的ET究竟來(lái)源何處？有研究證實(shí)顱底大血管壁中有ET，存在于內(nèi)皮及平滑肌上，且SAH后早期ET明顯增加.有人發(fā)現(xiàn)OxyHb能刺激培養(yǎng)的血管內(nèi)皮合成ET增加，且主要向基底面分泌［7］，故認(rèn)為可引起基底膜ET增加，ET穿過(guò)基底膜作用于平滑肌細(xì)胞.此外SAH后CSF，血管及下丘腦部位ET含量升高，CVS中ET含量變化與下丘腦部位含量變化有良好的相關(guān)性［8］；從蛛網(wǎng)膜下腔阻斷ET作用，能有效地預(yù)防和逆轉(zhuǎn)CVS，說(shuō)明ET作用血管是從CSF中血管外膜方面，且CSF中ET可能來(lái)源于下丘腦［9］.而本實(shí)驗(yàn)無(wú)論是從珠網(wǎng)膜下腔還是從靜脈內(nèi)給藥都能達(dá)到良好的效果，我們考慮ET1可能來(lái)自血管內(nèi)皮細(xì)胞和下丘腦兩個(gè)部位. 此設(shè)想有待進(jìn)一步研究.

　　【參考文獻(xiàn)】

　?。?/span>1］ Weir B.Subarachnoid Hemorrhage: Causes and Cures ［M］. New York: Oxford University Press,1988：32-39.

　　［2］ Zimmermann M, Jung C, Raabe A, et al. Inhibition of endothelinconverting enzyme  activity in the rabbit basilar artery［J］.  Neurosurgery, 2001;48: 902-908.

　　［3］ Ando K, Hirata Y, Shichiri M, et al. Presence of  immunoreactive endothelin in human plasma ［J］. FEBS Lett, 1989;245: 164-166.

　?。?/span>4］ Koseki C, Imai M, Hirate Y, et al. Autoradiographic localization of ［125 I］endothelin1 binding sites in rat brain［J］. Neurosci RES, 1989;6:581.

　?。?/span>5］ Ohkuma H, Parney 1, Megyesi J, et al. Antisense preproendothelinoligoDNA therapy for vasospasm in a canine model of subarachnoid hemorrhage［J］. J Neurosurg, 1999;90:1105-1114.

　?。?/span>6］ Matsumura Y, Lkegawa R, Tsukahara Y, et al. Conversion of big endothelin1 to endothelin1 by two types of metalloproteinases derived from porcine aortic endothelial cells［J］. FEBS Lett, 1990;272:166-170.

　　［7］ Yasimoto S, Ishizaki Y, Sasaki T, et al. Effect of carbon dioxide and oxygen on endothelin production by culture porine cerebral endothelial cells［J］. Stroke, 1991;22:378.

　?。?/span>8］ Wang XY, Zhu C, Zhang GJ, et al. Changes of endothelin during cerebral vasospasm after experimental subarachnoid hemorrhage［J］. Chin Med J, 1995;108（8）:586.

　?。?/span>9］ Clozel M, Watanabe H. BQ123, a peptidic endothelin ET receptor antagonist, prevents  the early cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage after intracisternal but  not intravenous injection［J］. Life Sci, 1993;52: 825-834.