HPLC法分析*及各類注射劑中有關(guān)物質(zhì)的含量

【資料簡(jiǎn)介】

【摘要】  目的 建立一種能用于*原料及制劑中有關(guān)物質(zhì)控制的HPLC方法。方法 采用XBridge Shield RP18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱溫30℃，流動(dòng)相為乙腈∶pH8.2磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L*溶液，用20%磷酸調(diào)節(jié)pH至8.2）（55∶45），流速1.0ml/min；檢測(cè)波長210nm；樣品溶液的進(jìn)樣量為200μg。結(jié)果 *與其雜質(zhì)（氮雜*A，*A肟，N去甲基*，*德糖胺以及*N氧化物）能達(dá)到基線分離；鹽酸、硫酸、乳糖酸、檸檬酸、馬來酸等*注射劑中常用酸根對(duì)*有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定無影響；方法的線性、準(zhǔn)確性、靈敏度以及粗放性均能滿足要求。結(jié)論 本文所建方法能較好地反映國產(chǎn)各種*原料及制劑中的有關(guān)物質(zhì)的情況，為國內(nèi)市場(chǎng)上不同*注射劑的評(píng)價(jià)、*及其口服制劑的質(zhì)量控制提供了較好的分析手段。

【關(guān)鍵詞】  *； 有關(guān)物質(zhì)； 原料； 制劑

RPHPLC determination of azithromycin and its related substances

    in durg substances and parenteral formulation

    Wang Mingjuan,  Xu Mingzhe,  Hu Changqin,  Wang Lixin  and  Wang Chen

    （National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,  Beijing 100050）

    ABSTRACT  Objective  To develop an HPLC method for determination the related substances of azithromycin in parenteral products.  Method  The separation was performed on a column of XBridge Shield RP18 （250mm×4.6mm, 5μm）, with acetonitrile∶pH8.2 phosphate buffer （0.05mol/L K2HPO4 solution, adjust pH to 8.2 with 20% phosphate acid） （55∶45） as the phase at flow rate of 1.0ml/min. The detection wavelength was 210 nm. The injection amounts of sample solutions were 200μg.  Result Azithromycin and its related substances, including azaerythromycin A, erythromycin A oxime, Ndemethylazithromycin, desosaminylazithromycin and azithromycin Noxide, can be well separated from each other on the developed system. The coexistence acids in azithromycin for injection e.g. HCl, H2SO4, lactobionic acid, maleic acid, citric acid, etc, did not interfere with the determination of the related substances. Linearity, accuracy, sensitivity and robustness of the method could meet the specific analytical requirements.  Conclusion Thedeveloped method can be successfully applied to the quality control of azithromycin drug substances and products.

    KEY WORDS  Azithromycin;  Related substances;  Drug substances;  Drug products

  
　 *為半合成堿性大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，由*A生成9肟衍生物后發(fā)生Bechman重排，再經(jīng)還原及N甲基化而成。*在水中幾乎不溶，在稀酸溶液中易溶；對(duì)酸較敏感，在酸溶液中可使**降解［1］。中國藥典2005年版中收載有*及其口服制劑，國內(nèi)新藥試行標(biāo)準(zhǔn)涵蓋了各類注射用*原料（鹽酸*、硫酸*、乳糖酸*、馬來酸*、**、**、*檸檬酸二氫鈉）及相應(yīng)的注射劑（粉針，小針劑及大輸液）。對(duì)上述原料及制劑的科學(xué)性評(píng)價(jià)已勢(shì)在必行。

    有關(guān)物質(zhì)檢查是目前藥品安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要指標(biāo)。雖然利用TLC可以有效地控制*原料中的有關(guān)物質(zhì)［1］，但HPLC法是zui常用的有關(guān)物質(zhì)檢查方法之一。采用HPLC法分析*有關(guān)物質(zhì)存在以下難點(diǎn)：①與其它大環(huán)內(nèi)酯類抗生素一樣，*在紫外區(qū)僅具有末端吸收，限制了其檢測(cè)靈敏度；②*屬堿性物質(zhì)，容易和色譜柱的硅醇基相互作用，導(dǎo)致色譜峰拖尾嚴(yán)重。中國藥典2005年版以及國家食品藥品管理局標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)*原料及其制劑中“有關(guān)物質(zhì)”的檢查均采用薄層色譜法；國外藥典則采用LC末端檢測(cè)或電化學(xué)檢測(cè)法檢查*有關(guān)物質(zhì)（表1）；另有文獻(xiàn)報(bào)道［2］，即使采用偏堿性流動(dòng)相，*及其雜質(zhì)在普通C18柱或鋁基質(zhì)色譜柱（USP中的L29色譜柱）中仍拖尾嚴(yán)重。新型的雜化顆粒色譜柱XTerra RP18能將*與其雜質(zhì)較好的分離，該方法已被EP5.0版收載。

    本文參考國外藥典［3～5］和文獻(xiàn)［2］的色譜條件，以*及其主要雜質(zhì)［氮雜*A（azaerythromycin A，EP中雜質(zhì)A）、*A肟（erythromycin A oxime）、N去甲基*（Ndemethylazithromycin）、*德糖胺（desosaminylazithromycin）、*N氧化物（azithromycin Noxide），結(jié)構(gòu)示意圖見圖1］的分離情況為指標(biāo)，建立了一種易在國內(nèi)普及、專屬性較好的HPLC末端檢測(cè)法。該法不僅能滿足對(duì)*原料中有關(guān)物質(zhì)的控制，且能較好的排除各種注射用*中各種酸根及其它輔料的干擾，并能滿足對(duì)各類*輸液相關(guān)物質(zhì)檢測(cè)的靈敏度。采用本方法分析*及各類注射劑中的有關(guān)物質(zhì)含量，為*注射劑的評(píng)價(jià)提供了科學(xué)的 表1        國外藥典中常用*有關(guān)物質(zhì)檢查方法的比較 數(shù)據(jù)。

    1  材料與方法

    1.1  儀器、試劑與樣品

    島津液相色譜系統(tǒng)：包括LC20AT型雙泵，SIL20AC型自動(dòng)進(jìn)樣器，SPDM 20A型PDA檢測(cè)器；Waters液相色譜系統(tǒng)：包括1525型雙泵，717plus型自動(dòng)進(jìn)樣器以及2487型雙通道紫外檢測(cè)器。

    *、磷酸均為分析純級(jí)（北京化學(xué)試劑廠），乙腈為色譜純級(jí)（Fisher公司）。

    *對(duì)照品（批號(hào)060090QCS）以及氮雜*A、*A肟、N去甲基*、*德糖胺、*N氧化物等雜質(zhì)對(duì)照品均由Pfizer公司提供；*原料（包括鹽酸*、硫酸*、乳糖酸*、馬來酸*、**、**、*檸檬酸二氫鈉）及相應(yīng)的注射劑（粉針，小針劑及大輸液）均為從流通市場(chǎng)上抽驗(yàn)到的國內(nèi)藥廠產(chǎn)品。

    1.2  溶液的制備

    （1）對(duì)照品溶液  取*及其雜質(zhì)對(duì)照品，分別精密稱定，用乙腈∶水（60∶40）溶解并分別配制成約0.1mg/ml的溶液，用于有關(guān)物質(zhì)峰定位以及方法學(xué)考察。分別精密量取1ml，混勻，作為混合對(duì)照品溶液。

    （2）樣品溶液

    ①原料  精密稱取適量，用乙腈∶水（60∶40）溶解（必要時(shí)先用乙腈助溶）并稀釋成約10mg/ml（以*計(jì)）的溶液；

    ②粉針劑  采用整瓶稀釋法，按標(biāo)示量用乙腈∶水（60∶40）溶解并稀釋成約10mg/ml的溶液；

    ③水針劑  取5支樣品，混勻后，精密量取適量，用乙腈∶水（60∶40）稀釋成約10mg/ml的溶液；

    ④大輸液  直接進(jìn)樣測(cè)定。

    1.3  色譜條件

    色譜柱：XBridge Shield RP18柱（Waters公司），250mm×4.6mm，5μm；CAPCELL PAK C18UG120（資生堂），150mm×4.6mm，5μm；Apollo C18（Grace公司），250mm×4.6mm，5μm和XTerra MS C18，50mm×4.6mm，2.5μm；柱溫30℃；乙腈∶pH8.2磷酸鹽緩沖液（0.05mol/L*溶液，用20%磷酸調(diào)節(jié)pH至8.2）（55∶45）；流速1.0ml/min；檢測(cè)波長210nm；進(jìn)樣量為20μl（大輸液中由于*濃度很低，zui高為2mg/ml，故通過加大進(jìn)樣體積使總的進(jìn)樣量為200μg）。

    2  結(jié)果

    2.1  HPLC方法的確定

    以*和5種*雜質(zhì)的分離情況為指標(biāo)，調(diào)整流動(dòng)相使得*與諸雜質(zhì)能達(dá)到較好的分離，且保持較好的峰形（圖2）。

    本色譜系統(tǒng)對(duì)色譜柱有一定的選擇性。*及其雜質(zhì)在雜化顆粒的C18柱（XBridgeTM Shield RP18和XTerra MS C18）和聚合物包被的C18柱（CAPCELL PAK C18 UG120）中峰形較好， 但在普通耐堿色譜柱*及其雜質(zhì)混合圖譜（Apollo C18）中峰形不理想，且內(nèi)嵌極性基團(tuán)的XBridge Shield RP18柱的選擇性與其它C18柱不同，內(nèi)嵌極性基團(tuán)的存在有利于難分離物質(zhì)對(duì)N去甲基*與*德糖胺的分離，建議采用硅膠表面經(jīng)雜化處理的十八烷基鍵合硅膠色譜柱，如XBridge Shield RP18（250mm×4.6mm，5μm）或與之相當(dāng)?shù)纳V柱，系統(tǒng)適用性指標(biāo)采用：①調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，使*峰的保留時(shí)間約為11min，此時(shí)*N氧化物、N去甲基*、*德糖胺、氮雜*A和*A肟相對(duì)于*的保留時(shí)間分別為0.35、0.48、0.52、0.58和0.62，上述雜質(zhì)相對(duì)于*的校正因子分別為0.62、0.70、1.66、0.77和2.94；②*峰的拖尾因子不得大于2.5；③*對(duì)照品溶液在100℃加熱30min后，*與其相鄰降解雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合規(guī)定（圖3B）。

    2.2  方法學(xué)考察

    按中國藥典2005版附錄XIXA［6］的相關(guān)規(guī)定，對(duì)所建方法的線性、定量限、檢出限、精密性、粗放性和溶液的穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。上述方法檢測(cè)*及其雜質(zhì)的zui低檢出限、zui低定量限、加樣回收率及線性范圍見表2。

    取混合對(duì)照品溶液200μl，連續(xù)進(jìn)樣5針，各物質(zhì)峰面積的RSD均小于0.4%；取不同時(shí)間配制的*對(duì)照品溶液進(jìn)樣，其響應(yīng)值的RSD小于0.5%（n=3）；說明方法的精密性良好。采用島津或者Waters液相色譜系統(tǒng)分析*原料及其制劑中的有關(guān)物質(zhì)，方法的靈敏度、專屬性均能滿足要求。 *：采用有關(guān)物質(zhì)已知的注射用*，利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)加入法（各雜質(zhì)濃度分別約為0.08、0.10和0.12mg/ml，n=3），考察方法的回收率；

    **：以進(jìn)樣量200μg計(jì)算。冬氨酸、*、檸檬酸二氫鈉等酸根對(duì)*有關(guān)物質(zhì)分析的影響，結(jié)果表明上述酸根均在接近死體積的位置（RRT約為0.27）出峰，均不干擾有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

    *溶液對(duì)酸和熱不穩(wěn)定，在0.1mol/L鹽酸中放置24h后主峰*消失（圖3A），所形成的雜質(zhì)經(jīng)雜質(zhì)對(duì)照品比對(duì)及LCMS確認(rèn)（流動(dòng)相同本法，但將乙腈∶磷酸鹽緩沖液改為乙酸鹽緩沖液）為其酸降解產(chǎn)物*德糖胺（EP中雜質(zhì)J）；在100℃加熱30min，雜質(zhì)也有明顯增加（圖3B），但降解雜質(zhì)均不干擾對(duì)相關(guān)物質(zhì)的測(cè)定。

    2.3  對(duì)*原料及制劑中有關(guān)物質(zhì)的分析

    在對(duì)國產(chǎn)*原料及諸制劑中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)①*葡萄糖或氯化鈉輸液中的雜質(zhì)含量zui高；在所檢測(cè)的90批樣品中約96%的*輸液中的雜質(zhì)總量已超過5.0%，個(gè)別樣品雜質(zhì)總量高達(dá)46%；約30%的*葡萄糖輸液和10%的*氯化鈉輸液的含量低于其標(biāo)示量的90%；圖4為*葡萄糖輸液的典型圖譜，該制劑中的zui大雜質(zhì)為*的酸性降解產(chǎn)物*德糖胺。②各類注射用*原料（鹽酸*、硫酸*、乳糖酸*、馬來酸*、**、*檸檬酸二氫鈉）及其注射劑（包括粉針劑、水針劑）中，雜質(zhì)總量一般在0.9%～4.0%，但是僅注射用*/*注射液（助溶劑為檸檬酸鈉）和注射用乳糖酸*的部分樣品中的雜質(zhì)總量能滿足USP30版（2007年增補(bǔ)版）的要求（≤2.0%）。③上述樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量與其成鹽或作為助溶劑的酸的性質(zhì)密切相關(guān)：鹽酸*、硫酸*及用磷酸為助溶劑的*注射劑中的總雜質(zhì)含量均超過3.0%，部分樣品甚至高達(dá)10%～20%；采用檸檬酸等弱酸作為助溶劑的注射用*的雜質(zhì)總量一般小于2.0%。通過比較*在不同酸中的穩(wěn)定性：放置24h后，*在0.05mol/L硫酸中主峰消失，在0.1mol/L馬來酸中主峰殘留約20%，但在0.1mol/L檸檬酸或0.1mol/L乳糖酸中僅約20%的*發(fā)生了降解，提示*注射劑中的雜質(zhì)主要來源于成鹽/助溶階段。④國產(chǎn)*原料中常見的zui大雜質(zhì)為氮雜*A、N去甲基*或EP中的雜質(zhì)B（RRT為1.26～1.29）（圖5）；在所考察的14批原料中僅有14%的樣品雜質(zhì)總量未超過2.0%，提示國產(chǎn)*原料的質(zhì)量有待進(jìn)一步提高。

    3  討論

    本文建立的易在國內(nèi)普及、專屬性較好的*有關(guān)物質(zhì)HPLC分析方法，較好地解決了*有關(guān)物質(zhì)分析的難題，為*及其口服制劑的質(zhì)量控制，為科學(xué)評(píng)價(jià)不同酸成鹽/作為助溶劑的各類*注射劑的產(chǎn)品質(zhì)量均提供了良好的分析手段。

    對(duì)各種*注射劑的分析表明，*葡萄糖/氯化鈉輸液中的雜質(zhì)含量zui高，這與*對(duì)酸敏感、對(duì)熱不穩(wěn)定的特性有關(guān)，因此，*輸液劑型本身是否合理值得思考。

    注射用*及其水針劑的質(zhì)量整體好于*輸液，其雜質(zhì)總量一般在0.9%～4.0%，但其雜質(zhì)的含量與其成鹽或作為助溶劑的酸的性質(zhì)密切相關(guān)，鹽酸*、硫酸*以及采用磷酸為助溶劑的*注射劑的雜質(zhì)含量明顯偏高，部分樣品中的雜質(zhì)總量高達(dá)10%～20%，提示科學(xué)評(píng)價(jià)國內(nèi)市場(chǎng)上含不同酸根的*注射劑劑型的合理性勢(shì)在必行。

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