非洲豬瘟試劑盒的工作原理

【資料簡(jiǎn)介】

非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒使用說明書（快提核酸擴(kuò)增試劑盒）

【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測(cè)試劑盒（PCR熒光探針法）
英文名稱：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預(yù)期用途］
本試劑盒主要用于檢測(cè)疑似感染豬抗凝血及臨床病料中的非洲豬瘟病毒（ASFV, African Swine FeverVirus）核酸，適用于非洲豬瘟病毒的檢測(cè)、輔助診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【試劑盒組分】
1、試劑盒組成及貯藏條件

名稱	50T	貯藏條件
1、反應(yīng)液A	ImL	-20°C
2、反應(yīng)液B	ImL
3、陽性對(duì)照	250μL
4、陰性對(duì)照	250μL
5、PCR反應(yīng)液	850μL
6、酶混合液	150μL

2、需自備材料：生理鹽水、無菌槍頭、熒光PCR專用反應(yīng)管、記號(hào)筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備
1、 血液樣品：采集抗凝血（抗凝劑為EDTA）或血清樣品，編號(hào)備用。
2、 組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品或軟蜱0.1g（黃豆粒大小），眼科剪剪碎于組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，再加1mL生理鹽水混勻，4°C條件下8000 rpm/分鐘離心2分鐘，取上清液于滅菌離心管中，編號(hào)備用。

二、DNA提取
取反應(yīng)液A 20μL分別加入到新的1.5mL離心管，加入抗凝而或血清或組織上清液2μL混勻，室溫（20°C左右）靜置3分鐘，加入反應(yīng)液B 20μL,吹打混勻即可，若為抗凝全血，則需8000rpm/分鐘再離心2分鐘后做為待檢DNA溶液。

二、PCR擴(kuò)增
1、配液：取出PCR反應(yīng)液、酶混合液，在室溫*融化后，充分混勻，瞬離，可將酶混合液全部取岀直接加入到PCR反應(yīng)液中，充分混勻，瞬離后按每份20μL分裝使用；或按照每份PCR反應(yīng)液17μL, 酶混合液3μL的比例取一定的試驗(yàn)用量，混合兩種反應(yīng)液,瞬離后按照每份20μL分裝到專用熒光PCR 反應(yīng)管中，剩余試劑立即凍存；（操作過程要注意避光）
2、加樣擴(kuò)增：分別向上述PCR反應(yīng)管中加入5μL樣本 DNA或陰性對(duì)照或陽性對(duì)照，混勻并瞬離, 放入熒光PCR儀上運(yùn)行以下程序：

步驟	條件	循環(huán)數(shù)
50°C：2分鐘	95 1
預(yù)擴(kuò)増	°C：8 秒  5
95°C：8 秒  40

熒光通道選擇FAM,在40循環(huán)階段每個(gè)循壞的55°C時(shí)收集熒光信號(hào)。設(shè)置擴(kuò)增體系為25μL,同時(shí)要選擇 passive reference 和 quencher 為 none 的模式。
(注:若熒光PCR儀(如ABI7500)按說明書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時(shí)間短無法運(yùn)行,可將預(yù)擴(kuò)增和PCR擴(kuò)增條件變更為95°C： 5秒 55°C：30秒。) 

【結(jié)果判定】
1、基線和閾值設(shè)定；基線調(diào)整取6-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對(duì)照檢測(cè) 熒光曲線的最高點(diǎn)為原則。
2、質(zhì)量控制：反應(yīng)結(jié)束后，陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無特定的擴(kuò)增曲線，Ct值為＞38或無；陽性對(duì)照 的Ct值應(yīng)≤30.0,且明顯的擴(kuò)增曲線；否則實(shí)驗(yàn)視為無效。
3、樣品判定：待檢樣品熒光信號(hào)有指數(shù)型增加，且結(jié)果顯示Ct值<35.0,報(bào)告為陽性；未檢測(cè)到Ct 值或Ct值＞38或無明顯擴(kuò)增曲線，則樣品判定為陰性。35≤Ct值≤8時(shí)，復(fù)檢一次，重復(fù)結(jié)果為陽性者判定為陽性，否則判定為陰性。