可溶性抗原（soluble antigen）的制備及鑒定

【資料簡介】

蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶類、補(bǔ)體、脂多糖、細(xì)菌外毒素和核酸等均為可溶性抗原，它們有相當(dāng)部分來源于組織和細(xì)胞，成分復(fù)雜。制備這類免疫原時(shí)，首先須將組織和細(xì)胞破碎，然后再從組織和細(xì)胞勻漿中提取目的蛋白或其他抗原，提純的抗原需鑒定后才能用做免疫原。

一、組織勻漿的制備

用于制備免疫原的材料必須是新鮮或低溫保存的。材料獲得后立即去除包膜或結(jié)締組織，臟器應(yīng)進(jìn)行灌洗，去除血管內(nèi)殘留的血液，用含0.5g/L NaN3的生理鹽水洗去血跡及污物；在4℃水浴或冰浴中將洗凈的*成0.3～0.5cm3小塊，加入適量生理鹽水，裝入搗碎機(jī)筒內(nèi)制成組織勻漿。組織勻漿經(jīng)3000r/min離心10min后，上清液作為提取可溶性抗原的材料。上清液在提取前還必須進(jìn)行離心去除細(xì)胞碎片及微小的組織。

二、細(xì)胞破碎

提取細(xì)胞的可溶性抗原，需將細(xì)胞破碎。根據(jù)細(xì)胞類型不同，選擇破碎的方法也有一定的差異，現(xiàn)介紹幾種常用的細(xì)胞破碎方法。

1、酶處理法

*、纖維素酶、蝸牛酶等在一定的條件能消化細(xì)菌和組織細(xì)胞。如*對(duì)革蘭陽性菌的細(xì)胞壁有溶菌作用。酶處理法適用于多種微生物細(xì)胞的溶解，該方法具有作用條件溫和、內(nèi)含物成分不易受到破壞、細(xì)胞壁損壞程度可以控制等特點(diǎn)。

2、凍融法

細(xì)胞主要因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度突然改變而破壞。其方法是將破碎的細(xì)胞置-15～-20℃冰箱內(nèi)*凍結(jié)，然后從冰箱取出，讓其在30～37℃中緩慢融化。如此反復(fù)兩次，大部分組織細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的顆?？杀黄?。此法適用于組織細(xì)胞，對(duì)微生物的細(xì)胞作用較差。

3、超聲破碎法

這是利用超聲波的機(jī)械振動(dòng)而使細(xì)胞破碎的一種方法。由于超聲波發(fā)生時(shí)的空腔作用（cavitation），使液體局部減壓，引發(fā)液體內(nèi)部流動(dòng)，在漩渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大的壓力而使細(xì)胞破碎。超聲波所使用的頻率從1～20kHz不等。進(jìn)行超聲破碎時(shí)，需間歇進(jìn)行，避免長時(shí)間超聲產(chǎn)熱，導(dǎo)致抗原破壞。也可將超聲粉碎的細(xì)胞置于冰浴降溫。超聲破碎細(xì)胞，方法簡單，重復(fù)性較好，且節(jié)省時(shí)間。微生物和組織細(xì)胞的破碎，均可采用此方法。

4、表面活性劑處理法

在適當(dāng)?shù)臏囟取H及低離子強(qiáng)度的條件下，表面活性劑能與脂蛋白形成微泡，通過細(xì)胞膜的通透性改變使細(xì)胞溶解。常用的表面活性劑有十二烷基磺酸鈉（SDS陽離子型），新潔爾滅，Triton X-100等。如將大腸桿菌濕菌體1g，加入2%濃度的Triton X-100作用60min，可使絕大多數(shù)大腸桿菌的菌體裂解。此方法作用比較溫和。在提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞。