PCR反應(yīng)條件-谷研生物

）PCR反應(yīng)成分
）模板
  單、雙鏈DNA均可。
  不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類(lèi)。
  DNA模板一般00ng /00?L。
  模板濃度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。

2）引物濃度
      0.-0.5 ?mol/L
    濃度過(guò)高易導(dǎo)致模板與引物錯(cuò)配,反應(yīng)特異性下降。

（3）Taq DNA聚合酶
      0.5-2.5 U/50 ?l
    酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過(guò)少影響反應(yīng)產(chǎn)量。
 

4）dNTP（0mM or 2.5mM ）
     含四種核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP
    dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度
    濃度過(guò)高易產(chǎn)生錯(cuò)誤堿基的摻入,濃度過(guò)低則降低反應(yīng)產(chǎn)量
    dNTP可與Mg2+結(jié)合,使游離的Mg2+濃度下降,影響DNA聚合酶的活性。
5） Mg2+
Mg2+是DNA聚合酶的激活劑。濃度為0.5-2.5mmol/L。
   Mg2+濃度過(guò)低會(huì)使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過(guò)高影響反應(yīng)特異性。
   Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。
2）循環(huán)參數(shù)
變性 
    使雙鏈DNA解鏈為單鏈
    94℃， 30-60秒
（2） 退火 
    溫度由引物長(zhǎng)度和GC含量決定。
    增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。
引物設(shè)計(jì)：
（）序列應(yīng)位于高度保守區(qū),與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源
    序列。
（2）引物長(zhǎng)度以5-40 bp為宜。
（3）堿基盡可能隨機(jī)分布,G+C占40-60%。
（4）引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。
（5）兩引物間避免有互補(bǔ)序列。
（6）引物3’端為關(guān)鍵堿基；5’端無(wú)嚴(yán)格限制。
3）延伸
      70-75℃,一般為72℃
      延伸時(shí)間由擴(kuò)增片段長(zhǎng)度決定
（4）循環(huán)次數(shù)
     主要取決于模版DNA的濃度
      一般為25-35次
       次數(shù)過(guò)多：擴(kuò)增效率降低
                 錯(cuò)誤摻入率增加