（二）材料

1. 生長成片的MDCK細(xì)胞

2. 無菌的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶

3. D-MEM培養(yǎng)液（含有L-）

4. 青、母液（10000 U/mLG；10000µg/mL硫酸），分裝后保存于-20℃

5. HEPES緩沖液，1M母液

6. 胎牛血清

7. EDTA-（0.05%，0.53mM EDTA-4Na），分裝后保存于-20℃

8. 7.5%牛血清白蛋白組分V

9. 1mL、10mL無菌移液管

10. 70％～75％的酒精

注意事項：經(jīng)常檢查試劑使用的有效期。

（三）實驗步驟

這里以T75細(xì)胞瓶的單層細(xì)胞培養(yǎng)為例，敘述MDCK細(xì)胞的培養(yǎng)程序。如果細(xì)胞瓶的規(guī)格有變，MDCK細(xì)胞懸液的量必須做相應(yīng)的調(diào)整。

1. D-MEM培養(yǎng)液的準(zhǔn)備 
500mL D-MEM液中加入：
青、母液5mL（終濃度達(dá)：100U/mL；100µg/mL），
HEPES緩沖液12.5mL（終濃度：25mM）。 
7.5%牛血清白蛋白組分Ⅴ 12.5mL 
2. 細(xì)胞生長液的準(zhǔn)備 
胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液體中，使胎牛血清的終濃度為10%。 
3. 首先將細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液棄去，加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-。 
4. 溫和地?fù)u動細(xì)胞瓶1min，使EDTA-均勻分布在整個細(xì)胞薄層。然后用移液管吸去EDTA。 
5. 重新加入5mL在37℃水浴中預(yù)熱的EDTA-重復(fù)上述步驟。 
6. 加入1mLEDTA-使其均勻分布在整個細(xì)胞薄層，37℃孵育細(xì)胞瓶直至細(xì)胞從塑料細(xì)胞瓶的表面分離（約5～10min）。必要時可以搖動或吹打來分離細(xì)胞。然后加入1mL胎牛血清滅活殘余的。 
7. 加9mL已經(jīng)配置好的含有L-的D-MEM培養(yǎng)液，輕輕用移動移液管來吹散細(xì)胞團(tuán)。 
8. 取10mL混合物加到90mL細(xì)胞生長液（細(xì)胞懸液的濃度大約為每毫升含105細(xì)胞） 
9. 每個T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶加入6mL（6×105/mL）細(xì)胞懸液，剩余的細(xì)胞懸液可以加到T75細(xì)胞瓶用于細(xì)胞傳代。通常6mL細(xì)胞懸液2～3日可生長成片（80％～90％）的單層細(xì)胞。 
10. 于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，以供進(jìn)一步實驗用。