一、材料與方法

1.  EDTA（無(wú)蛋白酶抑制劑）（Roche）

2.  酸沖洗過(guò)的425-600玻璃珠（Sigma）

3.  洋地黃皂苷（digitonin）（EMDChemicals）

4.  蛋白酶抑制劑（DMSO,亮肽素,抑制劑）（Sigma）

5.  BECKMAN1.5 ml 離心管（BECKMAN）

6.  抗FlagM2親和膠（Sigma）

7.  3XFLAG多肽（Sigma）

二、儀器設(shè)備

1.  BECKMAN離心機(jī)、TLA-55轉(zhuǎn)子

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1.  細(xì)胞裂解

（1）酵母搖至25OD，集菌。4℃，用1 ml H₂O或PBS緩沖液洗滌細(xì)胞。若需要，可在-80℃保存樣品。

（2）用150 ul 預(yù)冷好的免疫沉淀緩沖液重懸細(xì)胞，緩沖液（無(wú)DTT）中加入0.1%digitonin和蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑。加入玻璃珠沒(méi)于液面下。在冷藏室，渦旋振蕩10分鐘。Digitonin是強(qiáng)刺激性非離子去污劑，可以完整提取膜蛋白。

（3）加入850 ul 免疫沉淀緩沖液（包含1.16%Digitonin和蛋白酶抑制劑，無(wú)DTT），定容至1 ml。此時(shí)Digitonin終濃度為1%。4℃，翻轉(zhuǎn)搖床孵育30分鐘，此過(guò)程中膜蛋白可溶于緩沖液中。轉(zhuǎn)移液體至新的BECKMAN離心管中。

（4）100 000 g 離心10分鐘，去除為裂解的細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞膜。膜蛋白已從膜上分離，溶于上清中。離心（用TLA-55轉(zhuǎn)子，47 246 rpm），吸取上清。保存80 μl 上清，作為input對(duì)照。

2.  帶有FLAG標(biāo)簽的蛋白的免疫沉淀反應(yīng)

（1）每個(gè)反應(yīng)使用50 μl 膠懸浮液。（~25 μl 填充膠）。若使用親和柱則使用量更?。▇10 μl 填充膠，可以結(jié)合>1 μg FLAG-標(biāo)簽蛋白）。

（2）懸起抗-FLAGM2親和柱。懸浮液與填充膠的比例應(yīng)為2：1。轉(zhuǎn)移50 μl 懸浮緩沖液及親和柱至新的試管中。轉(zhuǎn)移應(yīng)使用移液管，并剪去其尖頭。

（3）400 g 離心1分鐘。靜置1~2分鐘。用移液管去除上清。

（4）用1 ml 含有0.1%digitonin的免疫沉淀緩沖液漂洗吸附柱，重復(fù)4次。洗滌過(guò)程中盡量保證漂洗液去除干凈，并且沒(méi)有丟失吸附柱。這是為了確保在蛋白結(jié)合柱子前，甘油已經(jīng)*去除。如果免疫沉淀樣品較多，可以同時(shí)漂洗吸附柱。在漂洗后，根據(jù)樣品數(shù)量分配吸附柱。每次漂洗，應(yīng)使用大于吸附柱體積20倍的漂洗液。（如25 μ l吸附柱，>500 μl 漂洗液）

（5）向漂洗過(guò)的吸附柱中加入800 μl 細(xì)胞裂解產(chǎn)物。可以用免疫沉淀緩沖液將總體積定容至1 ml。細(xì)胞裂解產(chǎn)物的體積取決于細(xì)胞中表達(dá)的帶有FLAG標(biāo)簽的蛋白的量。加入1 ml 裂解緩沖液作為負(fù)對(duì)照。

（6）攪動(dòng)樣品，在翻轉(zhuǎn)搖床上輕柔孵育2.5小時(shí)。

（7）400× g 離心1分鐘。用移液管去除上清。保存80 μl 上清作為未結(jié)合對(duì)照。

（8）用1 ml 免疫沉淀緩沖液漂洗吸附柱，重復(fù)4次。

3.  洗脫帶有FLAG標(biāo)簽的蛋白

用3×FLAG多肽洗脫。此方法洗脫效率*

（1）準(zhǔn)備3×FLAG洗脫緩沖液。加入30 μl 漂洗緩沖液（含0.25%digitonin和2 μg/μl 3×FLAG多肽）

（2）向有吸附柱的試管中加入30 μl 3×FLAG洗脫緩沖液。

（3）4℃，搖床輕柔孵育30分鐘。

（4）400~1 000× g 離心1分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至新試管中。注意不要吸入吸附柱