作為的CRISPR 系統(tǒng)，I型CRISPR-Cas的特征是有序的靶標(biāo)搜索和降解。首先，多亞基監(jiān)測(cè)復(fù)合物Cascade（用于抗病毒防御的CRISPR相關(guān)復(fù)合物）識(shí)別相匹配的兩側(cè)具有的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer-adjacent motif, PAM）的雙鏈DNA靶標(biāo)，促進(jìn)CRISPR RNA（crRNA）和靶DNA鏈之間形成異源雙鏈體，并將非靶DNA鏈置換掉，從而導(dǎo)致在靶位點(diǎn)上形成R-環(huán)（R-loop）。隨后，將具有解螺旋酶活性和核酸酶活性的酶Cas3特異性地招募到Cascade/R-loop上并切割和漸進(jìn)性地降解靶DNA鏈。來自褐色嗜熱裂孢菌（Thermobifida fusca, Tfu）的I-E型Cascade/R-loop和Cas3/單鏈DNA（ssDNA）復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)闡明了PAM識(shí)別和R-環(huán)形成機(jī)制。然而，Cas3招募、DNA切割和降解機(jī)制仍然是難以捉摸的。

這些研究人員解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割前狀態(tài)下的分辨率為3.7埃的低溫電鏡圖。Cas3的結(jié)合不會(huì)引起形成R-環(huán)的Cascade復(fù)合物發(fā)生進(jìn)一步構(gòu)象變化，這提示著Cascade-Cas3相互作用在很大程度上是一種構(gòu)象捕獲機(jī)制而不是一種誘導(dǎo)契合機(jī)制。 Cas3-Cascade相互作用*是由Cascade中的Cse1亞基介導(dǎo)的。Cas3對(duì)Cascade的識(shí)別是由于與Cascade/R-loop在電荷和表面輪廓上是互補(bǔ)的，但與Cascade的種泡狀態(tài)（seed-bubble state）并不是互補(bǔ)的。這是因?yàn)樵赗-環(huán)充分形成之前，Cse1的C-末端結(jié)構(gòu)域處于一種替 代性方向。通過與Cse1的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行廣泛接觸，Cas3能夠檢測(cè)Cse1的表面輪廓發(fā)生變化，從而排斥處于這樣的功能狀態(tài)下的Cascade。有條件地將Cas3招募到Cascade上就能夠避免錯(cuò)誤靶向僅具有部分互補(bǔ)性的DNA。

再者，這些研究人員提供了直接的證據(jù)表明一種底物移交機(jī)制對(duì)I-E型CRISPR干擾是至關(guān)重要的。Cas3的HD核酸酶結(jié)構(gòu)域直接捕獲非靶DNA鏈用于鏈切割，而且這種作用*繞過了它的解旋酶結(jié)構(gòu)域。這種底物捕獲依賴于非靶DNA鏈中存在的柔性凸起，而且這種切割位點(diǎn)偏 好性是由這種招募通路預(yù)先確定的。

這些研究人員進(jìn)一步解析出TfuCascade/R-loop/Cas3在非靶DNA鏈切割后狀態(tài)下的分辨率為4.7埃的結(jié)構(gòu)，這就允許他們鑒定出與這種鏈切割反應(yīng)相伴隨的結(jié)構(gòu)變化。這種結(jié)構(gòu)揭示出由于增加的柔性，R環(huán)區(qū)域中的完整非靶DNA鏈消失了。一旦腺苷5'-三磷酸（ATP）水解， 與PAM相鄰的一半非靶DNA鏈自發(fā)地重新定位到Cas3中的解旋酶結(jié)構(gòu)域的開口處。因此，在ATP水解時(shí)，Cas3的解旋酶結(jié)構(gòu)域讓非靶DNA鏈通過它自身并進(jìn)一步進(jìn)入Cas3的HD核酸酶結(jié)構(gòu)域，從而進(jìn)入一種漸進(jìn)性DNA降解模式。