過(guò)氧化物酶的輔基是血紅素。在體外將血紅素與牛血清白蛋白結(jié)合制備成含血紅素的蛋白質(zhì)分子作為模擬過(guò)氧化物酶。在確定血紅素與牛血清白蛋白結(jié)合后，檢測(cè)其的過(guò)氧化物酶活性。然后將此人工模擬酶固定在載體瓊脂糖凝膠（Sepharose 4B）上并裝柱，應(yīng)用于檢測(cè)樣品中痕量過(guò)氧化氫的含量，因?yàn)檫^(guò)氧化氫的測(cè)定不論是在臨床生物化學(xué)還是在環(huán)境化學(xué)和
食品工業(yè)中都具有重要意義。
血紅素是一活性分子，而血清白蛋白具有*吸附能力，所以兩者能結(jié)合。由于含有血紅素，該結(jié)合物就具有過(guò)氧化物酶的特性。瓊脂糖凝膠在激活后能很好的吸附蛋白質(zhì)分子從而把蛋白質(zhì)分子（模擬過(guò)氧化物酶）固定。過(guò)氧化物酶能極敏感的催化過(guò)氧化氫分解從而使鄰苯二胺變成有色物質(zhì)2，3-二氨基吩嗪，反應(yīng)如下：
模擬過(guò)氧化物酶的制備、固定與應(yīng)用
產(chǎn)物2，3-二氨基吩嗪在428nm處有光吸收峰，所以能以此反應(yīng)來(lái)測(cè)定過(guò)氧化物酶的活性和檢測(cè)過(guò)氧化氫的含量。
三．主要儀器與試劑
儀器： 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，搖床，水浴鍋，天平，布氏漏斗，恒流泵等。
試劑： 氯化血紅素、牛血清白蛋白，過(guò)氧化氫，鄰苯二胺，氨水，環(huán)氧氯丙烷，Sepharose 4B，1，4-二氧六環(huán)等。
四．操作步驟
1．以等摩爾數(shù)將牛血清白蛋白與氯化血紅素結(jié)合
稱取3.216g 牛血清白蛋白于少量水中溶解，后加水至約30ml。先用幾滴氨水使0.0312g氯化血紅素溶解，加少量水?dāng)噭?，然后在攪拌中緩慢滴?0℃的牛血清白蛋白溶液中，zui后使混合液zui終總體積為80ml。其中所含氯化血紅素和牛血清白蛋白的zui終濃度均為0.6mmol/L。在30℃水浴中20 分鐘（以上全班只做兩份）。該混合液經(jīng)吸收光譜測(cè)定確認(rèn)牛血清白蛋白與血紅素結(jié)合后，稀釋4 倍，以稀NaOH或稀HCl調(diào)pH 約為9.5。每組取16ml備用。
2．載體Sepharose 4B的活化
將適量的Sepharose 4B于燒結(jié)漏斗中（抽氣過(guò)濾）抽干，稱取8g（濕重），以100ml 1mol/LNaCl和100ml蒸餾水先后在漏斗上洗滌，抽干后移至小三角瓶?jī)?nèi)，加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml 環(huán)氧氯丙烷、15ml 56% 1，4－二氧六環(huán)，于40℃的恒溫?fù)u床中振搖活化2h后取出，在燒結(jié)漏斗中以蒸餾水和0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液洗滌、抽干。
3．模擬過(guò)氧化物酶與載體的連接
將10ml 牛血清白蛋白-氯化血紅素復(fù)合物（其余6ml 用作酶活力和偶聯(lián)率的測(cè)定）與活化的載體Sepharose 4B混合，在40℃搖床上振蕩偶聯(lián)24h 左右，在燒結(jié)漏斗中收集濾液，并用少許蒸餾水淋洗一并收集，量體積，用作未結(jié)合模擬酶的量的測(cè)定，算出偶聯(lián)率。將偶聯(lián)復(fù)合物用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液浸泡后裝柱。用相同緩沖液平衡。
4．模擬酶固定前活力的測(cè)定及固定后的應(yīng)用
固定前酶活力的測(cè)定：將2ml 20mmol/L鄰苯二胺與定量模擬酶（如可以是5、10、15μl等）混合后，再與1ml 20%過(guò)氧化氫混合，即用時(shí)間掃描測(cè)定反應(yīng)0.5 或1 分鐘時(shí)428nm處的吸光度，以O(shè).D 值/分.mg酶來(lái)表達(dá)酶的活力。
固定裝柱后對(duì)過(guò)氧化氫檢出值的測(cè)定：將柱子柱面上平衡液放至界面，把3ml 20mmol/L鄰苯二胺與含微量過(guò)氧化氫（如2μl）的水樣品1ml 混合，用恒流泵以0.5ml/min的流速使
樣品經(jīng)過(guò)柱子（洗脫液用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3 緩沖液），收集有色過(guò)柱液3ml并測(cè)428nm 的吸光值，以水代替過(guò)氧化氫與鄰苯二胺混合過(guò)柱作為對(duì)照。改變過(guò)氧化氫含量重復(fù)以上操作，測(cè)定出過(guò)氧化氫的zui低檢出值。以過(guò)氧化氫含量與OD 值的關(guān)系作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可測(cè)定污水或雨水中過(guò)氧化氫的含量（注意相同條件才能比較）。
5．載體與模擬酶偶聯(lián)率的測(cè)定
以1 克Sepharose 4B 偶聯(lián)模擬酶的毫克數(shù)表示。測(cè)定模擬酶與載體混合前還原態(tài)（加少許連二亞硫酸鈉使模擬酶還原）模擬酶在577nm 的吸光值（已知模擬酶的量），再測(cè)定偶聯(lián)后未結(jié)合的還原態(tài)模擬酶在577nm處的吸光值，通過(guò)比例法算出未結(jié)合模擬酶的數(shù)量，從而算出偶聯(lián)率。
附：主要物質(zhì)的分子量
牛血清白蛋白：66，411
氯化血紅素：652
模擬過(guò)氧化物酶：67，063