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上海士鋒生物科技有限公司
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培養(yǎng)基
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士鋒生物瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

時間:2014/4/23閱讀:1044
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原理: 瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物,可作為電泳支持物,適用于分離大小范圍在0.2-50kb的DNA片段。DNA分子的遷移率與分子量的對數(shù)值成反比關(guān)系。觀察其遷移距離,與標準DNA片段進行對照,就可獲知該樣品分子量大小。在質(zhì)粒抽提過程中,由于各種因素的影響,使質(zhì)粒dna呈現(xiàn)超螺旋的共價閉合環(huán)狀、開環(huán)狀分子、線狀分子三種不同的構(gòu)型,這三種分子有不同的遷移率。在一般情況下,超螺旋型遷移速度zui快,其次為線狀分子,zui慢的為開環(huán)狀分子。用熒光染料溴化乙錠(ethidium bromide, EB )進行檢測,溴化乙錠嵌入堿基對之間形成熒光絡合物,在紫外線激發(fā)下發(fā)出紅色熒光。

儀器與主要試劑:
儀器:
1) 電泳儀
2) 水平電泳槽
3) 紫外檢測儀
主要試劑:
1) 提取的質(zhì)粒DNA
2) 5×TBE:54gTris; 27.5g硼酸; EDTA (0.5mol/L, pH 8.0) 20ml, 加水至1L,用前稀釋10倍
3) 溴化乙錠(EB):10mg/ml溶液
4) 溴酚藍

實驗方法:
1) 稱取1g瓊脂糖于100ml 0.5×TBE中,加熱溶解,冷卻至65℃左右再加入終濃度為0.5%-1.0%的EB。
2) 電泳膠模兩端用透明膠帶封固,梳子至于適當位置,將冷卻至65℃左右的瓊脂糖溶液慢慢倒在膠模上,厚度約3㎜。靜置,待膠凝固后揭去膠模兩端的透明膠帶,放入電泳槽內(nèi),倒入適量電泳緩沖液(一般液面高出凝膠1㎝),小心拔出梳子。
3) 將5μg提取的質(zhì)粒DNA樣品,與等體積溴酚藍指示劑混勻,加入凝膠點樣孔內(nèi),防止產(chǎn)生氣泡和樣品溢出。
4) 將電泳槽通電,80V恒壓電泳30分鐘。
5) 電泳完畢,關(guān)掉電泳儀,倒去電泳槽中的電泳緩沖液,小心取出凝膠置于紫外燈下觀察結(jié)果,質(zhì)粒DNA條帶發(fā)出紅色熒光。

注意事項:
1) 防止紫外線對人皮膚及眼睛的損傷,避免直接照射皮膚與眼睛。
2) EB是強誘變劑,有致癌性,操作時要帶手套,防止污染。所有含有EB的溶液在棄置前應當進行凈化處理。

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