一、 灌膠
1. 把制膠器放在平穩(wěn)的臺(tái)面上。
2. 保持制膠器干燥，抬起兩側(cè)的羽狀開(kāi)關(guān)放開(kāi)卡門(mén)，平放，放進(jìn)橡膠墊圈并緊扣。先把厚玻璃平板放入，再放兩側(cè)的墊片，后放入帶凹型的玻璃平板。
3. 緊緊合上卡門(mén)，同時(shí)按壓兩側(cè)的羽狀開(kāi)關(guān)聽(tīng)到“咔嚓”聲音。
4. 倒分離膠：將配好的分離膠溶液用加樣槍緩慢加入制膠玻板之間,直至液面達(dá)到卡門(mén)邊框下緣線處。小心用加樣槍將去離子水沿水平方向加入制膠板中的分離膠液面上，以防止膠液蒸發(fā)并保證膠面平整。聚合大約需要30mins。
5. 倒?jié)饪s膠：分離膠聚合后，倒掉去離子水，用濾紙吸去殘液。在玻板中加滿(mǎn)濃縮膠溶液，輕輕地插入合適的梳子，梳子的厚面向?qū)嶒?yàn)者，避免產(chǎn)生氣泡。
30分鐘后，除去梳子，抬起兩側(cè)的羽狀開(kāi)關(guān)放開(kāi)卡門(mén)，拿出帶膠的制膠玻板。
6. 安裝電泳槽：按壓電泳槽夾具的開(kāi)關(guān)使卡門(mén)松開(kāi)，將玻璃夾板放入槽內(nèi)。注意，兩玻璃夾板的凹玻板均應(yīng)與電泳槽內(nèi)芯接觸。如果每次只電泳一塊膠，另一套玻璃夾板必須用提供的有機(jī)玻璃板代替。
7. 樣品處理：在等待濃縮膠聚合時(shí)，可對(duì)樣品進(jìn)行處理，在樣品中按1:1體積比加入上樣buffer，在100℃加熱3-5分鐘以使蛋白質(zhì)變性。
8. 加樣：在外水槽加電泳緩沖液至槽體的一半位置。放正槽體，繼續(xù)加注緩沖液，避免產(chǎn)生氣泡，使內(nèi)槽的水位均超過(guò)凹形板的缺口但低于方形板的上沿。用微量加樣器或普通加樣槍在梳井內(nèi)按預(yù)定順序加樣，加樣量通常為10～25μl。
9. 電泳：蓋好上蓋，在100—150V的電壓下電1—2小時(shí)，一般濃縮膠電壓80V20~30Min，分離膠120V80Min，到樣品指示劑到達(dá)玻璃板的下緣，關(guān)掉電源。取下玻璃夾板。用刀片或薄板將膠板玻璃橇開(kāi)，用單面剃刀片將分離膠切掉，將凝膠板的左上角切掉一小角以標(biāo)記樣品順序。
附錄
染色與脫色（考馬斯亮藍(lán)法）
1. 如上所述，將電泳好的凝膠板取出。手戴橡膠手套將凝膠小心移入染色器皿中。
2. 在染色皿中加入100ml考馬斯亮藍(lán)染液（含0﹒25﹪考馬氏亮藍(lán)R-250，45﹪甲醇，10﹪冰醋酸的水溶液），加蓋，在搖床上染色2小時(shí)。
3. 將染液倒回貯存瓶，反復(fù)使用。在染色皿中加入100ml脫色液（10﹪冰醋酸，45﹪甲醇），振蕩脫色3小時(shí)，也可反復(fù)更換脫色液，縮短時(shí)間。
膠的保存
用30﹪甲醇，7﹪乙酸，2-5﹪混合液振蕩處理1小時(shí)。
注意
1. 清洗玻璃板。玻璃板應(yīng)清洗干凈，玻璃表面的油污會(huì)造成分離膠與濃縮膠界面的不平整。經(jīng)用去污劑洗滌后的玻璃板先用蒸餾水沖洗，再用紗布蘸乙醇擦拭玻璃表面。
2. 分離膠濃度的選擇。低濃度膠對(duì)大分子量蛋白質(zhì)分離效果好：高濃度膠對(duì)小分子量蛋白質(zhì)分離效果好。
3. TEMED的加入量。TEMED是促進(jìn)丙烯酰胺聚合的加速劑。加*果隨試劑保存時(shí)間而變化。對(duì)于陳舊試劑，可適當(dāng)多加。事實(shí)上，配制分離膠時(shí)每塊膠板按2滴加入，效果也不錯(cuò)。
4. 電極緩沖液的配制。電極緩沖液的用量大、占體積、配制麻煩。如果經(jīng)常跑膠，可考慮配制5X濃度的濃縮液。方法如下：將144g和30﹒2gTris溶于1升蒸餾水中。使用時(shí)稀釋5倍。
5. 丙烯酰胺的毒性。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺都是神經(jīng)性毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用。但在形成凝膠后則無(wú)毒。操作時(shí)應(yīng)戴橡膠或塑料手套，盡量避免接觸皮膚，并注意實(shí)驗(yàn)后洗手。
電轉(zhuǎn)?。?/span>
正極（在下方，紅色電極） 兩層濾紙 NC膜或PVDF膜 PAGE
膠 兩層濾紙 負(fù)極（在上方，黑色電極）
定電壓：10V, 40~60Min
注意：NC膜要放在正極，要用手或滾子壓走氣泡。
轉(zhuǎn)印完畢，將NC膜取出，室溫干燥30-60min，浸入1%BSA的PBS液中4℃過(guò)夜封閉。
2） 酶免疫染色
① 取出封閉液中NC膜，含0.05%Tween-20的PBS洗滌5次,1-2min/次。
加入1：400的抗CD59McAb10ml，37℃1h。
② 含0.05%Tween-20的PBS洗滌5次,1-2min/次
③ 加入1：4000的羊抗鼠IgG10ml，37℃1h。
④ 含0.05%Tween-20的PBS洗滌5次,1-2min/次
⑤ 加入含0.06%DAB和H2O2的底物液,顯色20-30min。
觀察條帶情況，判斷結(jié)果。
電泳槽一般可分為三類(lèi)即：水平電泳槽，主要是進(jìn)行核酸分子的瓊脂糖凝膠電泳;垂直電泳槽可以在小批量核酸電泳和蛋白電泳中使用;轉(zhuǎn)移電泳槽主要是進(jìn)行蛋白樣品轉(zhuǎn)移的電泳儀。
