一、elispot.html' target='_blank'>ELISPOT 技術(shù)簡介

隨著酶聯(lián)免疫分析技術(shù)在醫(yī)學(xué)及生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 使體外檢測各種細胞因子及抗體研究有了新的突破。在研究免疫應(yīng)答機制時以往常用用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中游離的細胞因子（CK）或抗體，但由于游離的循環(huán)抗體或 CK 的半哀期不同，使之在體液中不斷的被代謝或與靶器官結(jié)合，而不能確切的反映體內(nèi)的抗體及CK 的水平。80 年代，國外的科研工作者根據(jù) ELISA 技術(shù)的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌細胞和 CK 分泌細胞的固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）。因其具有較高的特異性和敏感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用，對探索自身免疫系統(tǒng)疾病發(fā)病機制具有重要意義。

ELISPOT 法源自ELISA ，又突破傳統(tǒng)ELISA 法，是定量ELISA 技術(shù)的延伸和新的發(fā)展。兩者都是檢測細胞產(chǎn)生的細胞因子或其他可溶性蛋白，它們zui大的不同在于：

1、ELISA 通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準曲線比較得出可溶性蛋白總量。

2、ELISPOT 也是通過顯色反應(yīng)，在細胞分泌這種可溶性蛋白的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計數(shù)斑點或通過 CTL 公司的 ELISPOT 分析系統(tǒng)對斑點進行計數(shù)，1 個斑點代表 1 個細胞，從而計算出分泌該蛋白的細胞的頻率。（某些研究不僅要測細胞因子生成量，還需檢測分泌此細胞因子的細胞頻率）。

3、由于是單細胞水平檢測，ELISPOT 比 ELISA 和有限稀釋法等更靈敏，能從 20 萬 -30 萬細胞中檢出 1 個分泌該蛋白的細胞。

4、捕獲抗體為 BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生產(chǎn)的高親和力、高特異性、低內(nèi)毒素單抗，在研究者以刺激劑激活細胞時，不會影響活化細胞分泌細胞因子。

二、ELISPOT 檢測原理

細胞受到刺激后局部產(chǎn)生細胞因子，此細胞因子被特異單克隆抗體捕獲。細胞分解后，被捕獲的細胞因子與標(biāo)記的二抗結(jié)合，其后再與堿性磷酸酶標(biāo)記的親和素結(jié)合。BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF 孔板出現(xiàn)“紫色”的斑點表明細胞產(chǎn)生了細胞因子，通過 CTL 公司生產(chǎn)的 ELISPOT 酶聯(lián)斑點分析系統(tǒng)對斑點的分析后得出結(jié)果。

三、ELISPOT 分析儀的出現(xiàn)解決了以下問題

1、哪些斑點是抗原特異性T 細胞產(chǎn)生的（此斑點具有進一步分析價值），哪些是無關(guān)細胞產(chǎn)生的（此斑點沒有T 細胞研究價值）?

2、斑點大小的意義?

3、在對不同細胞因子計數(shù)和分析時，如何定義斑點zui大和zui小尺寸?

4、如何從單個細胞基礎(chǔ)上分析?

5、實驗度有多高?如果一個細胞產(chǎn)生相似的細胞因子，在多大程度上會干擾分析結(jié)果?6、幾次重復(fù)實驗才能使結(jié)果更有意義?