一、技術(shù)原理
酶標(biāo)儀，即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的專用儀器。它基于光電比色法或熒光檢測(cè)法，通過(guò)測(cè)量樣本對(duì)特定波長(zhǎng)光的吸收程度或熒光信號(hào)強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣本中待測(cè)物的定性和定量分析。
(一)光電比色法原理
酶標(biāo)儀的光源燈發(fā)出的光波經(jīng)過(guò)濾光片或單色器變成一束單色光，進(jìn)入塑料微孔板中的待測(cè)標(biāo)本。單色光一部分被標(biāo)本吸收，另一部分則透過(guò)標(biāo)本照射到光電檢測(cè)器上。光電檢測(cè)器將這些光信號(hào)轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的電信號(hào)，經(jīng)過(guò)一系列信號(hào)處理后送入微處理器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和計(jì)算，最后由顯示器和打印機(jī)顯示結(jié)果。特定波長(zhǎng)下，同一種被檢測(cè)物的濃度與被吸收的能量成定量關(guān)系，檢測(cè)單位用OD值(光密度)表示，OD值與光強(qiáng)度之間的關(guān)系遵循Bouger-amberT-beer法則。
(二)熒光檢測(cè)法原理
在熒光檢測(cè)中，酶標(biāo)儀通過(guò)特定波長(zhǎng)的激發(fā)光照射樣本，使樣本中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。光電檢測(cè)器接收熒光信號(hào)并將其轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，經(jīng)過(guò)處理后得到熒光強(qiáng)度值，該值與樣本中熒光物質(zhì)的濃度成正比。
(三)波長(zhǎng)選擇與雙波長(zhǎng)檢測(cè)
在測(cè)定檢測(cè)物時(shí)，選擇特定的波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)，稱為測(cè)量波長(zhǎng)。但每一種物質(zhì)對(duì)光能量還存在一定的非特異性吸收，為了消除這種非特異性吸收，再選取一個(gè)參照波長(zhǎng)。檢測(cè)波長(zhǎng)和參照波長(zhǎng)的吸光值之差可以消除非特異性吸收。例如，450nm和492nm兩個(gè)波長(zhǎng)是目前ELISA測(cè)定最-常用的，考慮到雙波長(zhǎng)比色的需要，還應(yīng)有630nm和405nm波長(zhǎng)的濾光片。
二、操作指南
(一)準(zhǔn)備工作
儀器放置：將酶標(biāo)儀、配套的電腦及主機(jī)等放在平穩(wěn)、干燥的地方。
電源連接與預(yù)熱：將酶標(biāo)儀與電腦連機(jī)，依次打開電腦和酶標(biāo)儀的開關(guān)，等待自檢，預(yù)熱5 - 30分鐘(不同型號(hào)儀器預(yù)熱時(shí)間可能不同)，使儀器達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。在預(yù)熱過(guò)程中，可根據(jù)具體情況設(shè)置所需要的波長(zhǎng)和光線強(qiáng)度。
軟件啟動(dòng)與程序設(shè)置：打開與儀器配套的軟件，建立新的檢測(cè)程序或打開已有程序。創(chuàng)建新程序時(shí)，選擇所需創(chuàng)建的程序協(xié)議，如吸光值、化學(xué)發(fā)光、熒光強(qiáng)度等;選定試驗(yàn)協(xié)議后，進(jìn)行波長(zhǎng)選定、酶標(biāo)板選定，并設(shè)置protocol參數(shù)，如酶標(biāo)板震蕩混勻樣品的時(shí)間、測(cè)量樣品結(jié)果的時(shí)間、樣品波長(zhǎng)掃描范圍以及樣品環(huán)境溫度等。修改已有程序時(shí)，在酶標(biāo)儀打開界面中選定一個(gè)protocol，然后雙擊進(jìn)入程序設(shè)置界面進(jìn)行相應(yīng)修改。
(二)樣品準(zhǔn)備
樣品制備與稀釋：根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備好待檢測(cè)的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，并進(jìn)行相應(yīng)的稀釋和加樣。同時(shí)，應(yīng)控制好稀釋倍數(shù)，避免樣品濃度過(guò)高或過(guò)低的影響。
微孔板布置：在酶標(biāo)板中按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)布置待測(cè)和標(biāo)準(zhǔn)樣品，每個(gè)孔位加入適量的稀釋后的樣品。同時(shí)，在同一板中添加對(duì)照組和空白對(duì)照。
(三)試劑添加
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求加入輔助試劑，如底物和酶標(biāo)記等。加入試劑時(shí)需要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行，按照正確的順序和比例加入試劑，避免污染和誤差。
(四)混勻和孵育
輕輕搖晃或輕輕拍打酶標(biāo)儀板，確保樣品和試劑充分混合。將酶標(biāo)儀板放置在恒溫條件下的孵化箱中進(jìn)行相應(yīng)的孵育時(shí)間，以促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。
(五)反應(yīng)停止和讀數(shù)
反應(yīng)停止：在孵育結(jié)束后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書中的指導(dǎo)，加入適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)停止劑，終止反應(yīng)。
讀數(shù)操作：將酶標(biāo)儀板放置在酶標(biāo)儀中，根據(jù)所測(cè)定的具體物質(zhì)選擇相應(yīng)的波長(zhǎng)或?yàn)V光片，讀取吸光度或熒光強(qiáng)度值。
(六)數(shù)據(jù)處理
根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，使用軟件或計(jì)算公式將讀數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化為所需的具體物質(zhì)的濃度或活性。點(diǎn)擊電腦軟件上的“編輯"欄中的“復(fù)制到Excel"，導(dǎo)出數(shù)據(jù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。
(七)儀器清理與維護(hù)
取出酶標(biāo)板：數(shù)據(jù)處理完成后，打開儀器蓋，取出酶標(biāo)板。
儀器清潔：蓋好儀器蓋，關(guān)閉酶標(biāo)儀電源，并將儀器擦拭干凈。
定期維護(hù)：按照設(shè)備的維護(hù)手冊(cè)，定期進(jìn)行維護(hù)和檢修工作，包括校準(zhǔn)和更換部件等。定期檢查儀器狀態(tài)，如光源是否正常、濾光片是否清潔等;儀器出現(xiàn)故障時(shí)，應(yīng)及時(shí)聯(lián)系專業(yè)工程師進(jìn)行維修，避免盲目自行設(shè)置。
