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上海莼試生物技術(shù)有限公司

甲醛變性電泳的原理和實驗程序

時間:2017-5-18閱讀:405
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進口檢測試劑盒用溴化乙錠等熒光染料示蹤的核酸電泳結(jié)果可用于判定核酸的純度。由于DNA分子較RNA分子大許多,電泳遷移率低;而RNA中以rRNAzui多,占到80%~85%,tRNA及核內(nèi)小分子RNA占15%~20%,mRNA占1%~5%。故總RNA電泳后可呈現(xiàn)特征性的三條帶。在原核生物為明顯可見的23S、16S的rRNA條帶及由5S的rRNA及由5S、5.8S的rRNA和tRNA構(gòu)成的條帶。mRNA因量少且分子大小不一,一般是看不見的。故可通過分析以溴化乙錠為示蹤染料的核酸凝膠電泳結(jié)果。

1. 甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制

進口檢測試劑盒在250 mL的錐形瓶中準確稱量2 g Agarose (Sigama),再加20 mL 10×TAE Buffer,144 mLDEPC處理過的雙蒸水,微波爐中化膠,待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5 μg/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛,放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

2. RNA的甲醛變性電泳

(1) 樣品制備

RNA總量:10 μg

5×甲醛凝膠電泳緩沖液:4 μl

甲醛: 3.5 μl

甲酰胺:10 μl

加入無菌離心管中混合,95℃水浴變性2 min(或55℃,15 min),取出后放入冰中冷卻。

(2) 加入2 μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三: 增大樣品密度,以確保DNA均勻進入樣品孔內(nèi);使樣品呈現(xiàn)顏色,便于加樣操作;能明確顯現(xiàn)樣品在電泳膠上的泳動位置。以 0.5 X TBE作電泳液時,溴*在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳動速率與長4 kb 的雙鏈線狀DNA相同。)

(3)進口檢測試劑盒將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中,點樣前5 V/cm預跑5 min。點樣后3-4 V/cm電泳。

(4)電泳結(jié)束后(溴*藍遷移到約8 cm處),紫外燈下觀察, 照相。

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