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轉(zhuǎn)膜實驗原理與操作步驟

時間:2016/8/12閱讀:733
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轉(zhuǎn)膜是把DNA 從瓊脂糖凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物(一般是尼龍膜)上固定,是進行各種后續(xù)研究(如 RFLP 分析,陽性克隆的篩選驗證等所有涉及分子雜交的研究)的前提。

實驗?zāi)康模?/p>

掌握 Southern Blotting 的原理及操作步驟

實驗原理:

1.轉(zhuǎn)膜的方式:

向上的毛細管轉(zhuǎn)移

向下的毛細管轉(zhuǎn)移

同時向兩張膜轉(zhuǎn)移

電轉(zhuǎn)移

真空轉(zhuǎn)移

2.固相支持物的種類及選擇:

硝酸纖維素膜:非共價結(jié)合,易脆,易丟失DNA , < 500 bp 的DNA 無效,轉(zhuǎn)膜前的工作(從提高轉(zhuǎn)膜效率,利于轉(zhuǎn)膜后使用等)。

尼龍膜(帶正電荷的)高強度,不易破損,具有較大的DNA 結(jié)合容量,它能夠吸附變性DNA ,核酸以共價結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有吸附DNA 的功能,無論用哪邊均可以經(jīng)久耐用,可反復(fù)利用 10 次以上( 10-20 次),經(jīng)毛細管(毛細吸附)作用,把DNA 從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。DNA 轉(zhuǎn)到膜上是復(fù)制膠上的帶型,在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ,即可固定DNA 。

3.轉(zhuǎn)移緩沖液( transfer buffer )的選擇:

帶正電荷的尼龍膜:可用高鹽離子強度( SSC ),但不能充分發(fā)揮膜潛能; 0.4N NaOH ,共價結(jié)合DNA 是zui大優(yōu)點。

硝酸纖維膜:高鹽離子強度促進DNA 與膜結(jié)合( 20 × SSC ),低鹽離子強度導(dǎo)致小片段DNA 在轉(zhuǎn)移過程中丟失, pH>9 ,DNA 不能與膜結(jié)合。

4.轉(zhuǎn)膜時間( duration of transfer )約 12 hrs。

取決于毛細管系統(tǒng),DNA 大小,膠厚度 (<5 mm) 及濃度 (<1%) 。

DNA 分子量大小決定時間長短,部分去嘌呤減小DNA ,堿轉(zhuǎn)移 2hrs 大部分結(jié)合到膜。

DNA 轉(zhuǎn)移的效率較難判斷,只有在轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,通過 EB 染膠,及分子雜交才可以鑒別效率高低,但已無補救措施,因此,每一步應(yīng)嚴格操作。

實驗材料及試劑: 酶消化好的DNA 樣品,尼龍膜, 0.2NHCl , 0.4N NaOH 等。

實驗步驟:

1.0.8% 瓊脂糖電泳。

制膠:注意瓊脂糖的質(zhì)量,膠的濃度,厚度(<5mm)及均一性。一般大電泳槽配制 250ml 0.8% 瓊脂糖凝膠,采用 42 孔梳子(經(jīng)濟,)。

制樣,點樣:DNA 樣品中指示劑量稍多。

電泳:一般 1-1.5V/cm 的電壓,使DNA 遷移到適當(dāng)距離,一般指示劑約移動 10-11cm ( 大電泳槽: 40V × 12-15hrs ,小電泳槽 30V × 4-5 hrs)。

2.轉(zhuǎn)膜前的準備:

依膠大小每塊凝膠準備兩張比膠稍大的濾紙( 11 × 12.5 cm ),兩張用作鹽橋的濾紙,一張與膠同樣大小的尼龍膜( 10 × 10.5cm ),兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、一根玻璃棒,比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

3.一玻璃盤中加入足量的 0.4N NaOH ,放上洗凈的玻璃板,按圖示搭制鹽橋 ( 操作示范 ) 。

4.凝膠的預(yù)處理:

a.從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上,用切膠板把膠切成適當(dāng)大小,切去右上角(zui后一個樣品的zui前端)作為電泳方向記號。

b.把凝膠翻面,放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盤中,輕輕搖動 10min ,使指示劑變黃色為止(脫嘌呤)。

c.倒去 HCl 溶液,加蒸餾水漂洗凝膠。

d.倒去蒸餾水,加 0.4N NaOH 中和。

e.同時在鹽橋濾紙上灑些 0.4 NaOH ,立即將膠放在鹽橋上(忌氣泡)。

5.膠的四周用塑料片與膠緊緊相連,防止短路(吸水紙與鹽橋相接)。

6.在膠面上倒足夠量 0.4N NaOH ,小心放置膜(預(yù)濕 0.4N NaOH )使膜覆蓋整塊膠(要求一次成功,不能移動)。

7.膜上放 2 張濾紙,濾紙大小為 15 × 12cm。

8.放不少于 5cm 厚的吸水紙,放上玻板,其上壓約 500g 的重物,轉(zhuǎn)膜 12 hrs 左右。

9.轉(zhuǎn)膜完畢,用 2 × SSC 漂洗膜兩次,各 5min 。用 EB 染膠以檢測轉(zhuǎn)移效果。

10.用兩張濾紙包住膜,置于 80-100 ℃的真空干燥箱中,干燥 2-4 hrs 。

深圳子科生物科技有限公司技術(shù)部,僅供參考!

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