組織切片伴隨著顯微鏡技術(shù)和免疫實(shí)驗(yàn)等的發(fā)展已經(jīng)得到廣泛的認(rèn)同和應(yīng)用。其中各種組織切片方法的操作步驟和應(yīng)用范圍各不相同，本文對(duì)其中的石蠟切片、蘇木精染色、結(jié)締組織染色等方法進(jìn)行介紹。

(一)常規(guī)石蠟切片的制備：

(1)取材與固定：切取組織時(shí)應(yīng)使用鋒利的刀、剪，切取組織塊時(shí)，從刀的根部開始向后拉動(dòng)切開組織。組織塊的厚度約為0.2~0.3cm，大小為1.5cm x 1.5cm x 0.3cm為宜。取好的組織塊用10%福爾馬林溶液固定24~48h。

(2)包埋：先經(jīng)梯度乙醇脫水后用二甲苯透明，然后入溶融的石蠟中浸透每次30min，共3次;再包埋。

(3)切片：包埋好的石蠟塊即可進(jìn)行切片;切片的厚度為5μm左右。

(二)蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色方法：

(1)脫蠟：主要用二甲苯脫蠟。

(2)梯度乙醇水化。

(3)自來(lái)水沖洗。

(4)蘇木精染色：水化后的切片放入蘇木精染液中浸5~20min，染細(xì)胞核。自來(lái)水沖洗3~5min。

(5)1%鹽酸乙醇分化5~30s。自來(lái)水沖洗1~3min。

(6)弱堿性水溶液返藍(lán)30s~1min。自來(lái)水充分沖洗5~10分鐘。

(7)伊紅染色：充分水化后的切片直接入伊紅染色液中，染細(xì)胞質(zhì)5~15min左右。

(8)梯度乙醇脫水。

(9)二甲苯透明。

(10)中性樹膠封片。

二、組織化學(xué)及免疫組織化學(xué)技術(shù)

(一)組織化學(xué)(histochemistry)：一般稱為特殊染色，基本原理是通過應(yīng)用某些能與組織細(xì)胞化學(xué)成分特異性結(jié)合的顯色試劑，定位地顯示組織細(xì)胞的特殊化學(xué)成分并保持原有的形態(tài)學(xué)改變，對(duì)一些代謝性疾病的診斷具有一定的參考價(jià)值。通過光鏡或電鏡觀察，可以檢測(cè)組織切片內(nèi)的蛋白質(zhì)、糖類、脂類、酶類、核酸與某些金屬元素等。

1.過碘酸雪夫氏染色(periodic acid-schiff stain，PAS染色)：過碘酸是一種氧化劑，它能氧化糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1.2乙二醇基使之變?yōu)槎?，醛與Schiff氏試劑結(jié)合，形成紅色的取代色素而得到定位。PAS染色可顯示糖原、中性黏液物質(zhì)、基底膜、軟骨、垂體、霉菌及寄生蟲等物質(zhì)。是廣泛應(yīng)用的染色方法。在腎小球腎炎時(shí)PAS染色可顯示基底膜和系膜區(qū)的改變。

染色方法：

(1)切片按常規(guī)脫蠟水洗，再用蒸餾水洗滌。

(2)0.5%~1%過碘酸水溶液氧化5~10min。

(3)蒸餾水充分洗滌，至少3次。

(4)Schiff氏試劑染10~30min。

(5)傾去染液后，直接用亞硫酸沖洗液處理切片3次，每次2 min，以達(dá)到分化。

(6)自來(lái)水沖洗5~10 min，使之顯現(xiàn)出紅色。然后蒸餾水洗1次。

(7)明礬蘇木精染核，自來(lái)水充分洗滌。

(8)95%乙醇及無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

結(jié)果判定：PAS陽(yáng)性物質(zhì)呈鮮紫紅色，其它組織淡粉紅色，細(xì)胞核呈淺藍(lán)色。

2.結(jié)締組織的染色方法

一般所說(shuō)的結(jié)締組織是指纖維性結(jié)締組織而言，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)基質(zhì)外含有較多的纖維成分，主要是膠原纖維、彈性纖維和網(wǎng)狀纖維，我們僅簡(jiǎn)述這三種纖維的常見染色方法。

(1)Mallory三色染色法：常用于判定多種組織、器官的病變程度及修復(fù)情況，區(qū)分腫瘤組織中的纖維成分與平滑肌。

染色步驟：

①中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。

②重鉻酸鉀液10min。

③蒸餾水沖洗2min，蒸餾水2次。

④酸性復(fù)紅液2min，蒸餾水稍洗。

⑤苯胺藍(lán)液20min，95%乙醇快速分化。

⑥直接用無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

結(jié)果判定：膠原和網(wǎng)狀纖維呈藍(lán)色。

(2)Van Gieson苦味酸酸性復(fù)紅法：可以顯示組織、器官的損傷、修復(fù)及硬化情況，特別是用于鑒別腫瘤組織中的膠原纖維與平滑肌纖維，可為診斷提供重要依據(jù)。

染色步驟：

①組織切片按常規(guī)脫蠟水洗。

②用Weigert蘇木素液染細(xì)胞核5~l0 min。

③自來(lái)水充分洗滌數(shù)分鐘。

④用顯微鏡檢查細(xì)胞核的著色程度，過深可用0.5%鹽酸乙醇分化。

⑤自來(lái)水洗至變藍(lán);用蒸餾水洗。

⑥用Van Gieson液染1~5 min。

⑦傾去染液，直接用95%乙醇分化和脫水。

⑧無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

結(jié)果判定： 膠原纖維呈深粉紅色，肌纖維、胞漿及紅細(xì)胞黃色，細(xì)胞核呈棕黑色或蘭黑色。

(3)網(wǎng)狀纖維染色-Wider染色法：可以用來(lái)顯示病變組織網(wǎng)狀支架的破壞情況。特別是在腫瘤病理診斷中，網(wǎng)狀纖維染色對(duì)于鑒別來(lái)源于上皮組織和間葉組織的惡性腫瘤具有重要價(jià)值。

染色步驟：

①組織切片脫蠟至水。

10%②磷鉬酸，2~5min。蒸餾水沖洗，5min。

1%③硝酸鈾，5s。蒸餾水沖洗，10s。

④氧化銀溶液，5~10min。

95%⑤乙醇速洗，1~2s。

⑥還原液還原，1~2s。蒸餾水沖洗，2min。

0.2%⑦氯化金調(diào)色，2~20s。蒸餾水沖洗，5min。

5%⑧次亞硫酸鈉，2min。蒸餾水沖洗，2min。

⑨核固紅染細(xì)胞核，5~10min。水稍洗。

⑩常規(guī)無(wú)水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固。

結(jié)果判定：網(wǎng)狀纖維呈黑色、細(xì)胞核呈紅色。

3.脂肪的染色方法：脂肪染色常用脂溶性色素，如蘇丹Ⅲ、蘇丹Ⅳ、油紅O等。這類染料既能溶于有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮內(nèi)，又能溶于脂肪內(nèi)。由于該類染料在脂質(zhì)中溶解度較大，染色時(shí)染料便從染液中轉(zhuǎn)移到被染的脂質(zhì)中去，使脂質(zhì)呈染液的顏色。主要用于顯示組織臟器的脂肪變性和類脂質(zhì)的異常沉著。

蘇丹Ⅲ(Ⅳ)染色方法：

(1) 冰凍切片用70%乙醇漂洗，不超過30s。

(2) 切片入蘇丹Ⅲ(Ⅳ)染液中3~15min或延長(zhǎng)至1h。

(3)新50%~70%乙醇分化，直至洗去切片上的浮色為止，蒸餾水洗。

(3) 用稀釋1倍的明礬蘇木精淺染核1min或稍長(zhǎng)。

(4) 用濾紙將切片及周圍的水分吸干。

(5) 用甘油或甘油明膠封固。

結(jié)果判定：脂肪呈桔黃色或桔紅色，細(xì)胞核淺藍(lán)色。

(二)免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry, IHC)：是指應(yīng)用免疫學(xué)和傳統(tǒng)的組織化學(xué)的原理，利用抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)對(duì)組織、細(xì)胞中的特定抗原(或抗體)進(jìn)行定位和定性的一種染色技術(shù)。具有較高的敏感性和特異性，其特點(diǎn)是將形態(tài)學(xué)改變與功能、代謝變化結(jié)合起來(lái)，直接在組織切片、細(xì)胞涂片或培養(yǎng)細(xì)胞爬片上定位一些蛋白質(zhì)或多肽類物質(zhì)的存在，并可到亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平，利用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)或激光共聚焦顯微鏡技術(shù)等可對(duì)被檢物質(zhì)進(jìn)行定量分析。標(biāo)記物為熒光、酶、免疫金銀及鐵標(biāo)記技術(shù)等。

IHC可用于各種蛋白質(zhì)或肽類物質(zhì)表達(dá)水平的檢測(cè)、細(xì)胞屬性的判定、淋巴細(xì)胞的免疫表型分析、細(xì)胞增殖和凋亡的研究、激素受體和耐藥基因蛋白表達(dá)檢測(cè)，以及細(xì)胞周期和信號(hào)傳導(dǎo)的研究等。

染色步驟：

(1)石蠟切片脫蠟至水(放入二甲苯中脫蠟后，梯度乙醇至水化)。

(2)3% H2O2室溫孵育5~10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。

(3)蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min，(如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行)。

(4)5%~10%正常山羊血清(PBS稀釋)封閉，室溫孵育10min。傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的*抗體或即用型*抗體，37℃孵育1h或4℃過夜。

(5)PBS沖洗，5min×3次。

(6)滴加適當(dāng)比例稀釋的生物素標(biāo)記二抗(1%BSA-PBS稀釋)或滴加生物素標(biāo)記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30min。

(7)PBS沖洗，5min×3次。

(8)滴加適當(dāng)比例稀釋的辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素(PBS稀釋)或辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30min。

(9)PBS沖洗，5min×3次。

(10)顯色劑顯色(DAB或AEC)。

(11)自來(lái)水充分沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。

結(jié)果判定：在光鏡下，陽(yáng)性細(xì)胞顯示出棕褐色 (DAB)或鮮紅色(AEC)。

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