I 分光光度法

一、目的
熟練掌握分光光度法檢測(cè)DNA純度和濃度的方法。
二、原理
DNA或RNA鏈上堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫光區(qū)具有較強(qiáng)吸收，其吸收峰在 260nm處。波長(zhǎng)為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關(guān)，也隨構(gòu)型而有差異。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1μg / ml時(shí)，DNA鈉鹽的OD260＝0.02
當(dāng)OD260＝1時(shí)，dsDNA濃度約為50μg / ml
ssDNA濃度約為37μg / ml
RNA濃度約為40μg / ml
寡核苷酸濃度約為30μg / ml（youyu底物不同有差異）
當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測(cè)定。一般情況下同時(shí)檢測(cè)同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算其比值來衡量樣品的純度。
經(jīng)驗(yàn)值：
純DNA：OD260/OD280≈1.8(＞1.9,表明有RNA污染；＜1。6，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）
純RNA：1.7 ＜OD260/OD280＜2.0（＜1.7時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染；＞2.0時(shí)表明可能有異硫氰酸殘存）
若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對(duì)核酸進(jìn)行定量，可使用方案二的方法或其他方法進(jìn)行估算。
三、材料、試劑及器具
1、材料
提取的PUC19樣品、PUC19標(biāo)準(zhǔn)樣品
2、試劑
滅菌重蒸水，TE緩沖液
3、器皿
石英比色皿；UV-240紫外分光光度計(jì)
四、操作步驟
1、UV-240紫外分光光度計(jì)開機(jī)預(yù)熱10min.
2、用重蒸水洗滌比色皿，吸水紙吸干，加入TE緩沖液后，放入樣品室的S池架上，關(guān)上蓋板。
3、設(shè)定狹縫后校零。
4、將標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（DNA5μl或RNA4μl用TE緩沖液稀釋至1000μl）后，記錄編號(hào)和稀釋度。
5、把裝有標(biāo)準(zhǔn)樣品或待測(cè)樣品的比色皿放進(jìn)樣品室的S架上，關(guān)閉蓋板。
6、設(shè)定紫外光波長(zhǎng)，分別測(cè)定230nm、260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的 OD值。
7、計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。
DNA樣品的濃度（μg / μl）:OD260×稀釋倍數(shù)×50/1000
RNA樣品的濃度（μg / μl）：OD260×稀釋倍數(shù)×40/1000

Ⅱ溴化乙錠法
一、目的
學(xué)習(xí)用溴化乙錠-標(biāo)準(zhǔn)DNA濃度比較法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)DNA的濃度。
二、原理
溴化乙錠（EB）是一種嵌入型染料，其上的一個(gè)扁平的基團(tuán)可插入到DNA或 RNA鏈的堆積堿基之間。溴化乙錠的嵌入基團(tuán)與堿基的接近使二者緊密結(jié)合。DNA吸收254nm的紫外輻射并傳遞能量給EB，而EB本身在302nm和 366nm處有光吸收。吸收的能量在590nm處釋放，并表現(xiàn)為橙紅色熒光。結(jié)合的EB的熒光產(chǎn)率遠(yuǎn)大于游離EB的熒光產(chǎn)率。EB結(jié)合量的多少與DNA的大小和構(gòu)型有關(guān)，而熒光強(qiáng)度正比于嵌入溴化乙錠的量。對(duì)于單一構(gòu)型的同種DNA樣品來說，溴化乙錠的嵌入量與樣品溶液的DNA含量成正比。
三、材料、試劑及器具
1、標(biāo)準(zhǔn)DNA樣品:已知濃度的線型DNA，以TE稀釋為梯度濃度的一系列標(biāo)準(zhǔn)樣品。
2、質(zhì)粒DNA的酶切樣品（待測(cè)）
3、溴化乙錠（EB）5μg / ml：以PH8.0的TE稀釋10mg/ml母液而的。
4、紫外透射儀。
四、操作步驟
黑色塑料板（或其他替代物）
↓
在其上點(diǎn)上兩排溴化乙錠2μl液滴，每排六點(diǎn)
↓
取標(biāo)準(zhǔn)樣品2μl與*排溴化乙錠混勻，則各點(diǎn)的DNA濃度分別為
（單位：ng/μl）:20、15、10、5、2、1
↓
取待測(cè)樣品經(jīng)過梯度稀釋后，各加2μl于第二排的溴化乙錠上混勻
梯度稀釋（單位：μl）
↓
把以上塑料板放到紫外投射儀的樣品臺(tái)上
↓
關(guān)好樣品室門。以短波紫外光激發(fā)熒光。觀察每一點(diǎn)的熒光強(qiáng)度或拍照。
比較上下兩排得亮度，確定待測(cè)樣品的濃度
五、注意事項(xiàng)
1、標(biāo)準(zhǔn)樣品含單一種類的DNA，且大小與待測(cè)樣品相近。
2、待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品使用同樣的體積.
3、EB具有中度毒性、強(qiáng)致癌性，操作時(shí)切記戴手套，切勿沾染到衣物、皮膚、眼晴、口鼻等。
4、沾有EB的用具使用完畢統(tǒng)一集中于回收容器中，經(jīng)凈化處理后方可棄。

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