基本原理：實(shí)驗(yàn)所用報告基因載體為pFR-Luc編碼螢火蟲（Firefly）熒光素酶。為了消除每個孔轉(zhuǎn)染效率不同的影響，實(shí)驗(yàn)時共轉(zhuǎn)pRL-TK作為內(nèi)對照，該質(zhì)粒編碼海腎（Renila）熒光素酶。這兩種熒光素酶的底物和反應(yīng)緩沖液不同，所以可以用同一樣品在同一個試管中測定。實(shí)驗(yàn)時，首先加入LARⅡ，測量Firefly熒光素酶活性，然后加入Stop&GloReagent，消除Firefly熒光素酶活性，同時激發(fā)Renila熒光素酶的活性并測量。這兩種試劑均由試劑盒提供。zui終結(jié)果取Firefly與Renila熒光素酶讀數(shù)的比值獲得相對熒光值（RLU）。細(xì)胞

（1）準(zhǔn)備反應(yīng)溶液

1）PLB（PASIVELYSISBUFFER）：使用前將5×PLB用無菌的蒸餾水稀釋至1×，一般用24孔板，每孔80μl；

2）LARⅡ（LuciferaseAsayReagentⅡ）：在熒光素酶底物中加入10mlBufer，混勻（1ml分裝），-70℃存放；

3）Stop&GloReagent：將20μl底物以20μl分裝（進(jìn)口小管），存放于-70℃冰箱。使用時加入到1ml分裝的緩沖液中即可。

（2）裂解細(xì)胞

1）4-48h后收取細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基，用1×PBS輕柔洗2遍后，加入1×PLB反應(yīng)液80-10μl（需*浸沒細(xì)胞）。每3耀5min搖晃1次，室溫15min；

2）將裂解液轉(zhuǎn)移至無菌小管，120rpm離心30s，取上清轉(zhuǎn)移至新的無菌小管。測量應(yīng)該在2h內(nèi)進(jìn)行，如果需要可儲存在-70℃冰箱中，但要注意每次凍融約有50%的熒光素酶活性丟失。

（3）測量熒光素酶活性

1）預(yù)熱熒光計(jì)，設(shè)定參數(shù)，每次延遲2s后開始測定，測定時間為10s。用空的一次性測量管進(jìn)行調(diào)零。

2）將40μlLARⅡ加入一次性測量管中；

3）將10μl細(xì)胞裂解液加入其中，混勻，放入熒光劑開始測量，記錄Firefly熒光素酶讀數(shù)；

4）加入40μlStop&GloReagent，混勻，放入熒光劑開始測量，記錄Renila熒光素酶讀數(shù)；繼續(xù)測量其他樣品。

5）計(jì)算Firefly與Renila熒光素酶讀數(shù)的比值，取3個平行孔的平均值，并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。