1、儀器設(shè)備

酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（Bio－550）；酶標(biāo)板 （96孔）；微量注射器。

2、試劑

 （1）HRP標(biāo)記羊抗兔Ig G（1:1 000，國(guó)產(chǎn)）；標(biāo)準(zhǔn)牛IgG；兔抗牛血清（1:256）；

 （2）包被液：0.05mol/L pH9.6碳酸緩沖液,4℃，保存, Na2CO3 0.15g, NaHCO3 0.293g,蒸餾水稀釋至100 mL。 

（3）稀釋液與洗滌液：0.01mol/LpH7.4 PBS--Tween--20, ４℃，保存。NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween—20，0.5mＬ。蒸餾水加至1000mＬ。

（4）封閉液：含0.1%明膠0.01mol/L PBS， pH7.4。

（5）鄰苯二胺底物溶液（臨用前配制）：臨用前將Na2HPO4·12H2O 2.9g,檸檬酸0.51g溶于100mL蒸餾水中, 再加入40mgOPD，40μL30%H2O2。

（6）終止液：2mol/LH2SO4。于500mL蒸餾水中加入98%濃硫酸76mL混均即可。

3、操作方法

 （1）將抗原結(jié)合在酶標(biāo)板上。取標(biāo)準(zhǔn)IgG（10mg/mL）用碳酸鹽緩沖溶液稀釋，得到濃度為0.1μg/mL的包被液，每孔加人100μL抗原包被液，并以不加標(biāo)準(zhǔn)抗原的兩孔為對(duì)照，為反應(yīng)的0%值，將反應(yīng)板于4℃放置一夜（8個(gè)樣品，分3個(gè)平行，4個(gè)100%值孔；共28+2孔）。

（2）標(biāo)準(zhǔn)牛IgG與初級(jí)抗體一兔抗牛血清的反應(yīng)。將標(biāo)準(zhǔn)IgG（10mg/mL）用稀釋液作二倍稀釋得到一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)牛IgG（4μg/mL至0.325μg/mL）各200μL，加到入32倍稀釋好的200μL的兔抗牛血清中，其中4個(gè)不加標(biāo)準(zhǔn)牛IgG作為測(cè)量時(shí)的100%值。4℃反應(yīng)放置一夜。

（3）封閉板。將包被好的酶標(biāo)板孔內(nèi)液體傾去，進(jìn)行洗滌，各孔加200μL洗滌液后室溫下放置1min，倒掉，如此重復(fù)4次后，在吸水紙上拍干，加封閉液進(jìn)行封閉，在37℃放置45min（注意：空白孔也要加封閉液）。封閉后，如前述洗滌。

（4）向酶標(biāo)板中加人標(biāo)準(zhǔn)抗原和抗體的混合物。將標(biāo)準(zhǔn)牛IgG和兔抗牛血清的混合物取100μL加入到酶標(biāo)板孔內(nèi)，同是4個(gè)未加抗原的100%值的平行樣也加入酶標(biāo)板中。37℃放置2h，再洗板4次。

（5）加人HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G。洗滌后每孔加100μL稀釋好的HRP-羊抗兔IgG，37℃放置1h，洗滌。

（6）加人OPD底物。洗板4次后，每孔加人100μL底物溶液，于37℃暗處反應(yīng)20min后，每孔加人50μL結(jié)束反應(yīng)液以終止反應(yīng)。

（7）吸收測(cè)定。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定波長(zhǎng)為492nm下的吸光值。

（8）數(shù)據(jù)處理。標(biāo)準(zhǔn)曲線是以Ig（標(biāo)準(zhǔn)牛IgG含量）對(duì)B/Bo作圖，求得線性方程。其中，C為標(biāo)準(zhǔn)牛IgG含量；B為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)牛IgG吸收值與0%吸收值之差;Bo為100吸收值與0%吸收值之差。