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主要用途

組織氧化應(yīng)激活性氧羥自由基比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過(guò)捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧化，進(jìn)而與偶氮染料反應(yīng)，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物，由分光光度儀比色分析 ，來(lái)定量檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)羥自由基活性氧族的生成和增加的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過(guò)精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。適用于各種組織（動(dòng)物、人體等）裂解懸液的羥自由基檢測(cè)，以及羥自由基激發(fā)劑和抗氧化清除劑（scanvenger）等的檢測(cè)?？梢员挥糜诩?xì)胞凋亡、信號(hào)傳遞、衰老、代謝和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等的研究。產(chǎn)品嚴(yán)格無(wú)菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，顯色清晰。

技術(shù)背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O2-）、過(guò)氧化氫（hydrogen peroxide；H2O2）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH-）、過(guò)氧化基（peroxyl radical；ROO-）、氫過(guò)氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO-）、過(guò)氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線(xiàn)態(tài)氧氣（singlet oxygen）等細(xì)胞內(nèi)活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產(chǎn)生和增多，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應(yīng)性和毒性，同時(shí)半衰期短（10－9至10－10秒）。其產(chǎn)生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過(guò)氧化物和次氯酸反應(yīng)、過(guò)氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產(chǎn)生黃色產(chǎn)物偶氮亞砜（diazosulfone），通過(guò)分光光度儀（325nm波長(zhǎng)），檢測(cè)未反應(yīng)棕色成分，以測(cè)定羥自由基的含量。據(jù)此證明組織細(xì)胞內(nèi)活性氧族的存在。其反應(yīng)系統(tǒng)為：

            DMSO   +    OH      → MSA  +  CH3

                 MSA  +diazonium dye   →  diazosulfone +   H+

產(chǎn)品內(nèi)容

清理液（Reagent A）    120毫升

標(biāo)記液（Reagent B）    300微升

酸性液（Reagent C）    1毫升

染色液（Reagent D）    5瓶

凈化液（Reagent E）                                    30毫升

終止液（Reagent F）    50毫升

萃取液（Reagent G）                                     30毫升

穩(wěn)定液（Reagent H）         2.5毫升

標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）     2毫升

產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)      1份

保存方式

保存染色液（Reagent D）和標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent G）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里；酸性液（Reagent C）和凈化液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全；凈化液（Reagent E）、萃取液（Reagent F）容易揮發(fā)，注意密閉；有效保證6月

用戶(hù)自備

1.5毫升離心管：用于標(biāo)準(zhǔn)液配制的容器

2.2毫升離心管：用于樣品操作的容器

5毫升玻璃管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

DOUNCE勻漿器：用于組織細(xì)胞裂解

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品操作

1毫升1厘米光徑石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器

分光光度儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、樣品準(zhǔn)備 

• 手術(shù)取出動(dòng)物組織，并秤重以確定500毫克組織重量 
• （選擇步驟）放進(jìn)預(yù)冷的15毫升錐形離心管
• （選擇步驟）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
• 移入到一個(gè)液氮凍存管
• 即刻放進(jìn)液氮罐過(guò)夜
• 次日從液氮罐里取出，即刻（zui快速度）用研磨棒碾碎組織成粉末狀（注意：切莫使組織凍融）
• 放進(jìn)一個(gè)15毫升錐形離心管
• 加入1毫升清理液（Reagent A）
• 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化組織（約80下）
• 將所有組織勻漿物移入1.5毫升錐形離心管
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為10000g
• 小心移取3毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升錐形離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入450微升清理液（Reagent A）到2至5號(hào)管
• 移取900微升標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到1號(hào)管
• 小心移取450微升1號(hào)管的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取450微升2號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取450微升3號(hào)管稀釋的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見(jiàn)下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)測(cè)定

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出5毫升清理液（Reagent A）到染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，加入5毫升凈化液Reagent E），混勻后，移取5毫升上層液相到新的10毫升瓶里(注意使用PE或玻璃瓶），標(biāo)記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用6次）。然后進(jìn)行下列操作

標(biāo)記為染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用6次）。 放在暗室里備用。然后進(jìn)行下列操作

• 移取400微升上述配制的標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent I）到2毫升離心管
• 加入40微升酸性液（Reagent C）
• 加入800微升染色工作液，手動(dòng)混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入1.2微升終止液（ReagentF），手動(dòng)混勻
• 渦旋震蕩1秒
• 靜置分層
• 移取1毫升上層液相到新的2.2毫升離心管
• 加入1毫升萃取液（Reagent G），手動(dòng)混勻
• 渦旋振蕩1秒
• 靜置分層
• 小心移取1毫升上層液相到新的比色皿
• 加入100毫升穩(wěn)定液（Reagent H）
• 上下傾倒混勻
• 即刻放進(jìn)分光光度儀（420nm波長(zhǎng)）檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至15四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)MSA濃度（微摩爾/升）